M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 2

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

1

M

ORFOLOGIA BAKTERII

Małe zróżnicowanie kształtów, wyróżniamy 3 zasadnicze kształty: kulisty, cylindryczny

(wydłużony) i nitkowaty.

1. Formy kuliste, noszą nazwę ziarniaków (coccus) i mogą tworzyć układy (jeśli po

podziale komórki się nie rozłączają)

- ziarniak micrococcus,

- dwoinka diplococcus,

- czwórniak, czworak tetracoccus (tetragenes),

- pakietowiec (sześcianka) sarcina,

- paciorkowiec streptococcus,

- gronkowiec staphylococcus.

2. Formy cylindryczne

- laseczka bacillus (dłuższe),

- pałeczka bacterium (krótsze),

3. Inne formy

- maczugowiec corynebacterium,

- przecinkowiec vibrio,

- śrubowiec spirillum

- krętek spirochaeta

- formy nitkowate np. promieniowce mają komórki podobne do strzępek grzybów

Formy przetrwalne różnią się od komórek wegetatywnych budową i składem chemicznym.

Wykazują odporność na szkodliwe działanie czynników zewnętrznych, m.in. wysoką

temperaturę (ważna rola w skażeniach żywności). Wytwarzane są przez laseczki (tlenowe

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 2

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

2

Bacillus i beztlenowe Clostridium), promieniowce, bakterie śluzowe. Pałeczki nie

wytwarzają przetrwalników.

Bakterie nie przekraczają 2



m średnicy i 3-5



m długości, z wyjątkiem form nitkowatych

osiągających kilkadziesiąt mikrometrów. Obserwacje bakterii prowadzi się w badaniach

mikroskopowych, w preparatach przyżyciowych, częściej jednak martwe komórki barwione

w preparatach utrwalonych.

PREPARATY MIKROSKOPOWE I BARWIENIE DROBNOUSTROJÓW

Małe wymiary komórek mikroorganizmów nie pozwalają na ich obserwację okiem

nieuzbrojonym. Do badania morfologii, oceny liczebności czy żywotności drobnoustrojów

stosuje się obserwacje mikroskopowe preparatów wykonanych bezpośrednio z materiału

badanego (np. preparaty odciskowe) lub z hodowli.

Przygotowane preparaty można oglądać bezpośrednio pod mikroskopem lub dodatkowo je

wybarwić.

Celem barwienia jest:



odróżnienie bakterii od składników otoczenia,



umożliwienie obserwacji cech morfologicznych i diagnostycznych (m.in. kształt,

wielkość, wzajemny układ komórek w hodowli, tzn. występowanie komórek

pojedynczo lub w różnych układach, obecność otoczek, zdolność ruchu, ilość i

rozmieszczenie rzęsek/wici, sposób rozmnażania się – przez podział, tworzenie

pączków, zarodników i form przetrwalnych) w celu rozróżnienia poszczególnych

grup drobnoustrojów między sobą i odróżnienia pewnych szczegółów w budowie,



wykazanie zmian czynnościowych w komórce,



ułatwienie liczenia drobnoustrojów (żywych, martwych).

Barwienie drobnoustrojów jest procesem fizykochemicznym, który polega na wniknięciu

barwnika do wnętrza komórki i utworzeniu barwnego kompleksu z cytoplazmą.

Barwienie bakterii zależy:

- od stanu fizykochemicznego barwnika i odbarwiacza,

- natury barwionych drobnoustrojów,

- zewnętrznych czynników natury fizycznej i chemicznej wspierających proces barwienia.

W zależności od sposobu barwienia wyróżniamy barwienia przyżyciowe i barwienie

preparatów utrwalonych.

1 . Przygotowanie preparatów przyżyciowych

Preparaty przyżyciowe służą do obserwacji ruchliwości, żywotności, sposobu

rozmnażania, a czasami do wykrywania substancji zapasowych. Najczęściej prowadzi się

obserwacje drożdży i pleśni ze względu na ich budowę i rozmiar. Obserwacja bakterii, ze

względu na małe rozmiary, ogranicza się jedynie do oceny ich ruchliwości.

Preparaty przyżyciowe wykonuje się na szkiełku podstawowym (w kropli spłaszczonej),

a w przypadku badania ruchliwości bakterii lub prowadzenia obserwacji nad sposobem

rozmnażania drożdży preparaty wykonujemy na szkiełku z wgłębieniem zwanym komorą

Lindnera (w kropli wiszącej).

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 2

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

3

Wykonywanie preparatu w kropli spłaszczonej

Na odtłuszczonym szkiełku podstawowym (wyjęte z alkoholu, dokładnie wytarte

i trzykrotnie przeciągnięte nad płomieniem palnika) umieszcza się kroplę płynnej hodowli

drobnoustrojów i nakrywa szkiełkiem nakrywkowym, opuszczając je ukośnie w celu

wyeliminowania pęcherzyków powietrza (rys). Nadmiar płynu osusza się bibułą filtracyjną.

Przy sporządzaniu preparatu z hodowli na podłożu stałym lub z produktów o konsystencji

mazistej należy nanieść na szkiełko najpierw kroplę jałowej wody destylowanej, a następnie

pobrany za pomocą ezy materiał rozprowadzić w tej kropli. Całość nakryć szkiełkiem

nakrywkowym.

Preparaty przyżyciowe należy oglądać bezpośrednio po przygotowaniu, żeby nie

dopuścić do przeschnięcia materiału. Najlepszą jakość uzyskuje się przy preparatach cienkich,

blisko brzegu kropli.

Schemat wykonania preparatu przyżyciowego

Wykonywanie preparatu w kropli wiszącej (w komorze Lindnera)

Komora Lindnera to szkiełko podstawowe z wgłębieniem. Brzegi wgłębienia komory

Lindnera smaruje się wazeliną (1). Na środku odtłuszczonego szkiełka nakrywkowego

umieszcza się kroplę badanej hodowli (2), szkiełko szybko odwraca się i przykleja do

brzegów wgłębienia w ten sposób, aby kropla wisiała w powietrzu mniej więcej na środku

wgłębienia (3). Lekko docisnąć szkiełko, wazelina uszczelnia i spowalnia wysychanie

preparatu (rys). Najlepiej oglądać preparat blisko brzegu kropli gdzie jest najcieńszy.

Preparat w komorze Lindnera

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 2

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

4

Barwienie preparatów przyżyciowych

Preparat przyżyciowy może być barwiony lub nie barwiony. Chcąc wykonać

barwienie obok kropli z materiałem badanym umieszcza się kroplę barwnika, miesza ezą

i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym. Stosowane barwniki nie mogą być toksyczne i

muszą się charakteryzować wysoką kontrastowością. Mimo że używa się ich w bardzo

dużym rozcieńczeniu i tak wywołują zahamowanie rozmnażania.

Przykłady:



barwienie błękitem metylenowym (rozcieńczenie 1:10 000) pozwala ocenić żywotność

drożdży; barwnik przenika do wnętrza martwej komórki, która barwi się na

ciemnoniebiesko,



barwienie płynem Lugola umożliwia wykrycie w komórce drożdży substancji

zapasowych – glikogenu, który barwi się na brunatno, a cytoplazma komórki jasnożółto,



barwienie bakterii płynem Lugola pozwala u gatunków beztlenowych wykryć

granulozę - cukier stanowiący substancję zapasową tych bakterii.

Mechanizm barwienia przyżyciowego może być różny i nie jest on jeszcze do końca poznany.

Prawdopodobnie jest wynikiem:

- chemicznego wiązania ze składnikami komórki,

- elektroadsorpcji barwnych anionów i kationów,

- rozpuszczania się barwnika w określonych składnikach chemicznych komórki.

2. Wykonanie preparatów utrwalonych

Preparaty utrwalone możemy podzielić na:



Trwałe – mogą być używane wielokrotnie przez długi czas,



Półtrwałe – jednorazowego użytku.

Preparaty półtrwałe

Preparaty półtrwałe uzyskuje się przez wykonanie rozmazu drobnoustrojów na

szkiełku podstawowym, a następnie utrwalenie i wybarwienie (rys). Nie zatapia się ich w

balsamie.

Wykonanie rozmazu

Technika zależy od konsystencji badanego materiału. Jeśli mamy do czynienia z

pożywką płynną, to sporządzenie rozmazu polega na rozprowadzeniu kropli cienką warstwą

na środku odtłuszczonego szkiełka podstawowego. Rozmaz wykonuje się ezą, suszy na

powietrzu. Jeśli materiał pochodzi z hodowli stałej należy najpierw na szkiełku umieścić

kroplę wody i następnie – pobrany ezą materiał – rozprowadzić w tej kropli.

Z mięsa i produktów mięsnych, ryb, żółtego sera wykonuje się preparaty bezpośrednio

z badanych próbek. W tym celu wycięty jałowym skalpelem kawałek (np. mięsa, sera

twardego, wędliny) przenieść jałową pincetą na szkiełko podstawowe i odcisnąć na nim

wyraźny ślad, cienki i bez wolnych przestrzeni. Po wykonaniu rozmazu preparaty zostawiamy

do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.

Technika wykonywania preparatu bakteriologicznego (rozmaz)

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 2

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

5

1. odtłuścić szkiełko podstawowe (wyjąć z alkoholu, dokładnie wytrzeć i trzykrotnie

przeciągnąć nad płomieniem palnika)

2. przy pomocy ezy nanieść na środek 1-2 kropli płynu fizjologicznego (lub wody)

3. przenieść niewielką ilość materiału bakteriologicznego do płynu fizjologicznego i

sporządzić zawiesinę,

4. wykonać rozmaz (rozprowadzić po całej powierzchni szkiełka),

5. wysuszyć na wolnym powietrzu,

6. trzymając szkiełko w szczypcach Cornetta, utrwalić rozmaz przesuwając go

trzykrotnie przez płomień palnika,

7. ostudzić szkiełko i ewentualnie dalej wykonać barwienie.

Schemat

wykonania

preparatu

półtrwałego

Utrwalanie preparatów

Utrwalenie przerywa zachodzące w komórkach procesy fizjologiczne i pozwala

zachować strukturę komórek, zapobiegając zmianom pośmiertnym. Ma na celu:



zabicie komórek drobnoustrojów;



przyklejenie się komórek do powierzchni szkiełka – nie spłukuje ich barwnik ani

woda;



odsłonięcie w ścianach komórkowych martwych mikroorganizmów związków, z

którymi łączy się barwnik.

Utrwalanie możemy wykonywać metodą:



termiczną – wyschnięty preparat przeprowadzamy 3-krotnie w pozycji poziomej

(rozmazem do góry) przez płomień palnika (część nie świecącą)



chemiczną – do badania struktur komórkowych, przy użyciu 60–70% alkoholu, 10%

formaliny, sublimatu lub mieszaniny eteru i alkoholu (1:1). W tym celu na wysuszony

rozmaz nalewa się odpowiedni odczynnik. Po 5–10 min. zlewa się utrwalacz, suszy na

powietrzu i barwi jedną z podanych metod. Używając sublimatu lub formaliny należy

preparat dobrze przemyć wodą i wysuszyć.

roz

m

az

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 2

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

6

Preparaty utrwalone barwi się, co pozwala na określenie kształtu drobnoustrojów, a także

obserwację układów komórek i struktur komórkowych.

Barwienia preparatów utrwalonych

W mikrobiologii mają zastosowanie następujące sposoby barwienia:



barwienie proste – gdzie używamy jednego roztworu barwnika, preparat zalewa się

barwnikiem na kilka sekund do kilkunastu minut, barwnik zlewa się, spłukuje wodą,

alkoholem lub acetonem i osusza bibułą; stosowane w celu ustalenia kształtu i układu

komórek, np. barwienie fioletem krystalicznym lub błękitem metylenowym



barwienie złożone – stosowane znacznie częściej, z użyciem co najmniej 2

roztworów barwników, barwienie albo w ściśle określonej kolejności albo ich

mieszaniną; np. barwienie metodą Grama

W zależności od stosowanych barwników, można wyróżnić 3 sposoby barwienia:



barwienie pozytywowe (pozytywne) – polegające na zabarwieniu komórek, podczas

gdy tło zostaje bezbarwne; może być proste lub złożone,



barwienie negatywowe (negatywne) – uzyskanie kontrastu między ciemnym tłem a

nie zabarwionymi komórkami; stosowane jest zwykle do barwienia krętków i otoczek

bakterii; wykorzystuje się roztwór nigrozyny, tuszu chińskiego lub cyjanochiny,

rozmaz wykonuje się z zawiesiny komórek zmieszanych z barwnikiem, nie utrwala

się, tylko od razu po wysuszeniu ogląda pod mikroskopem, może być proste lub

złożone,



barwienie pozytywowo-negatywowe – połączenie powyższych metod, najpierw

wykonuje się barwienie negatywowe, a po wyschnięciu dobarwia się barwnikiem

pozytywowym.

Preparaty trwałe

Przygotowanie preparatów trwałych obejmuje kilka etapów, z których najistotniejsze to:

utrwalenie, barwienie i zatopienie preparatu.

Utrwalenie materiału na szkiełku podstawowym można dokonać za pomocą czynników

fizycznych (ogrzewanie szkiełka z rozmazem zawiesiny drobnoustrojów w płomieniu

palnika) lub chemicznych (etanol, metanol, formalina, kwas pikrynowy, dwuchromian

potasu). Po wyschnięciu preparat barwi się, a następnie pokrywa balsamem kanadyjskim.

Po przykryciu szkiełkiem nakrywkowym, lekko ogrzewa do rozpuszczenia balsamu, dociska

szkiełko i usuwa nadmiar balsamu. Tak przygotowany preparat może być przechowywany

przez długi czas.

Barwienie błękitem metylenowym

Jest to barwienie proste, które stosujemy w celu ustalenia kształtu i układu komórek. Na

utrwalony preparat, umieszczony w kuwecie do barwienia, nakrapia się błękit metylenowy

według Löfflera (5 min), po czym preparat spłukuje się wodą, suszy i ogląda pod immersją.
Wykonać preparat z wybranej koloni z posiewów z poprzednich ćwiczeń.

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 2

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

7

Barwienie fioletem krystalicznym

Jest to barwienie proste. Na utrwalony preparat, umieszczony w kuwecie do barwienia,

nakrapia się fiolet krystaliczny (2 min), po czym preparat spłukuje się wodą, suszy i ogląda

pod immersją.

Wykonać preparat z wybranej koloni z posiewów z poprzednich ćwiczeń.

Barwienie negatywne

Polega na uzyskaniu kontrastu między ciemnym tłem a nie zabarwionymi komórkami.

Stosowane jest zwykle do barwienia krętków i otoczek bakterii; wykorzystuje się roztwór

nigrozyny, tuszu chińskiego lub cyjanochiny. Rozmaz wykonuje się z zawiesiny komórek

zmieszanych z barwnikiem, nie utrwala się, tylko od razu po wysuszeniu ogląda pod

mikroskopem, może być proste lub złożone.

W barwieniu negatywnym bakterie gramdodatnie (Bacillus, Sarcina, Staphylococcus)

wykazują zjawisko atrakcji barwnika, polegające na większym skupieniu (zagęszczeniu) się

cząstek barwnika w bezpośrednim otoczeniu, na obwodzie lub na zewnątrz niezabarwionej

komórki.

Bakterie gramujemne, np. pałeczki nie wykazują zjawiska atrakcji barwnika, tło preparatu

jest równomiernie wybarwione, natomiast w wielu wypadkach można zaobserwować w

środku niewybarwionych komórek, delikatną smugę lub punkcik, co tłumaczy się większą

przepuszczalnością błony komórkowej u bakterii gramujemnych w porównaniu z

gramdodatnimi.

Protokół barwienia negatywowego

1. na szkiełko podstawowe nanieść zawiesinę komórek bakteryjnych,

2. dodać barwnik (kroplę) np. nigrozynę lub tusz,

3. wykonać rozmaz (drugim szkiełkiem podstawowym),

4. suszyć na powietrzu, nie utrwalać termicznie!

5. preparat jest gotowy do oglądania po wyschnięciu.