

Izolacja limfocytów ze śledziony:

1. Ułożyd mysz na prawym boku.

2. Odkazid skórę etanolem, a następnie naciąd i odciągnąd skórę.

3. Przeciąd otrzewnę i uwidocznid śledzionę.

4. Wyciąd śledzionę (jałowe nożyczki i pęsetka).

5. Umieścid śledzionę na szalce Petrie’go z 10% MEM.

6. „Wyczesad” śledzionę jałową igłą preparacyjną lub nożyczkami.

7. Zebrad płyn (z limfocytami) do probówki.

8. Odstawid zawiesinę na ok. 15 min. w celu oddzielenia się większych fragmentów

tkanki śledziony.

9. Zebrad klarowny płyn do probówek, wirowad – 1500 rpm przez 5 min, a następnie

zlad supernatant.

10. Osad komórek zawiesid w 1ml 10% MEM.



Barwienie błękitem tryopanu:



Barwienie błękitem trypanu to proste barwienie dające możliwośd

oceny żywotności

populacji komórek

. Barwnik przenika do komórek przez uszkodzoną błoną

komórkową,

barwiąc je na niebiesko

. Nie pozwala rozróżnid komórek nekrotycznych

i apoptotycznych



Określenie żywotnośd limfocytów:

1. Pobrad próbkę zawiesiny komórek i rozcieoczyd 1:10 w PBS .

2. Dodad 4 krople 0,1% wodnego roztworu błękitu trypanu.

3. Kroplę zabarwionej zawiesiny nanieśd na szkiełko podstawowe i nakryd szkiełkiem

nakrywkowym.

4. Policzyd 100 komórek, określając jaki procent komórek zabarwił się koloidowym

barwnikiem (są to komórki martwe).

5. Wynik wyrazid w procencie żywych komórek.