MATERIAŁY XXXVI ZJAZDU FIZYKÓW POLSKICH – TORUŃ 2001 – WYKŁADY SEKCYJNE

Chemiczna identyfikacja

pojedynczych makromolekuł

za pomocą mikroskopii sił atomowych

Piotr E. Marszałek

Mayo Clinic and Foundation, Rochester, Minnesota, USA

1. Wstęp

Mikroskop sił atomowych (AFM) jest stosunkowo

nowym (1986 r.) narzędziem umożliwiającym wizu-
alizację pojedynczych molekuł i mechaniczne mani-
pulacje nimi [1]. Pionowe rozciąganie pojedynczych
cząsteczek można przeprowadzać w środowisku cie-
kłym w temperaturze pokojowej z rozdzielczością sił
F < 10 pN oraz długości l < 1 nm, co umożliwia po-
miary molekuł biologicznych. Liczne przykłady zasto-
sowań AFM w dziedzinach fizycznych i biologicznych
zapoczątkowane w ubiegłej dekadzie wskazują, że przy-
rząd ten powoduje prawdziwą rewolucję w nanotech-
nologii i bionanotechnologii [2–10].

Mechaniczne rozciąganie za pomocą AFM poje-

dynczych cząsteczek polisacharydów (polimerów zbu-
dowanych z cząsteczek glukozy lub cząsteczek do niej
zbliżonych) wykazało, że pierścienie glukozy ulegają
wymuszonym zmianom konformacyjnym, które powo-
dują skokowy wzrost długości polimeru, rejestrowany
jako plateau krzywej opisującej zależność między na-
prężeniem a długością [2,5,6,9]. Obserwacje te stały się
podstawą nowej metody AFM – spektroskopii mecha-
nicznej, której celem jest pomiar wymuszonych mecha-
nicznie zmian konformacyjnych w pojedynczych czą-
steczkach i wykorzystanie charakterystyki tych zmian
do identyfikacji struktur nieznanych cząsteczek [2,9].
Celem niniejszej pracy jest omówienie niedawnych ba-
dań, które wykorzystując mechaniczną spektroskopię
AFM umożliwiły m.in. wykrycie, na poziomie poje-
dynczych cząsteczek, obcych molekuł w próbkach po-
wszechnie używanych roślinnych polisacharydów [9].
Obserwacje te wskazują, iż w najbliższej przyszłości
możliwe będzie stosowanie AFM jako przyrządu anali-
tycznego w badaniach biopolimerów, mającego możli-
wości identyfikacji i analizy pojedynczych cząsteczek,
co nie jest osiągalne żadną inną tradycyjną metodą
spektroskopową.

2. Zasady spektroskopii mechanicznej AFM

Rysunek 1 przedstawia schematycznie budowę mi-

kroskopu sił atomowych AFM oraz zasady pomiaru

Rys. 1. Budowa i działanie spektrografu mechanicz-
nego (AFM). a) Uproszczony schemat mikroskopu AFM.
b) Rozciąganie cząsteczki polimeru generuje w niej na-
prężenie entropowe, które powoduje wygięcie mikrobelki
AFM (∆z

c

). Polimer zbudowany jest z segmentów o dłu-

gości l

k

(jest to tzw. długość statystycznie niezależnych

segmentów Kuhna w modelu FJC). c) Zależność między
długością a naprężeniem dla pojedynczej molekuły ce-
lulozy (linia kropkowana – pomiar AFM; linia ciągła –

model FJC).

176

POSTĘPY FIZYKI

TOM DODATKOWY 53D

ROK 2002

MATERIAŁY XXXVI ZJAZDU FIZYKÓW POLSKICH – TORUŃ 2001 – WYKŁADY SEKCYJNE

sprężystych właściwości pojedynczych cząsteczek poli-
merów. Badana próbka (zwykle jest to monowarstwa
polimerów zaadsorbowanych z roztworu do szkła lub
złota) jest umieszczona na wierzchu bloku piezoelek-
trycznego, przesuwającego ją w stronę czujnika siły,
którym jest sprężysta mikrobelka AFM (długość ok.
0,5 mm, stała sprężystości k ok. 100 mN/m), zakoń-
czona od strony próbki ostrym stożkiem (ang. AFM
tip) o promieniu krzywizny 10–20 nm. Po doprowa-
dzeniu do kontaktu między próbką a stożkiem mikro-
belki (siła nacisku 1–50 nN) cząsteczki polimeru ad-
sorbują również do stożka mikrobelki (mechanizm nie-
rozpoznany). Ponieważ promień krzywizny stożka jest
bardzo mały, w większości kontaktów z próbką żadna
cząsteczka nie zostaje zaadsorbowana. W ok. 10%
kontaktów pojedyncza cząsteczka adsorbuje do stożka
i może być mechanicznie rozciągana, gdy blok piezo-
elektryczny przesuwa próbkę w dół, oddalając ją od
mikrobelki (rys. 1b). Naprężenie powstałe w cząsteczce
powoduje wygięcie ∆z

c

mikrobelki AFM (rys. 1b),

które mierzone jest za pomocą fotodiody, rejestrują-
cej zmiany położenia wiązki laserowej odbitej od po-
wierzchni mikrobelki (rys. 1a). Siła naprężenia jest
dana wzorem F = k∆z

c

; stałą sprężystości mikro-

belki k wyznacza się np. za pomocą pomiaru widma
fluktuacji termicznych swobodnej mikrobelki [11].

3. Polimery – sprężyny entropowe

Cząsteczki polimerów przyjmują w roztworze nie-

regularny kształt – konformację „kłębka” (ang. ran-
dom coil), która odpowiada maksymalnej entropii po-
limeru. Długość polimeru L definiuje się jako długość
odcinka łączącego w linii prostej końce polimeru. Pod-
czas rozciągania polimeru w AFM jego długość wzra-
sta, gdyż przypadkowo zorientowane segmenty zostają
zmuszone do ułożenia się w linii prostej, co powoduje
zmniejszenie entropii polimeru. Wydłużanie cząsteczki
wymaga więc nakładu pracy sił zewnętrznych i po-
woduje wzrost naprężenia w cząsteczce, dążącego do
przywrócenia jej pierwotnego kształtu. Takie zacho-
wanie polimerów jest podstawą ich sprężystości entro-
powej. Początkowo w miarę rozciągania polimeru jego
naprężenie rośnie bardzo wolno; wzrost ten staje się
wykładniczy przy długościach cząsteczki przekracza-
jących 90% jej całkowitej długości, mierzonej wzdłuż
konturu cząsteczki (rys. 1c). Właściwości sprężyste
prostych polimerów modeluje się wykorzystując kon-
cepcję „freely jointed chain” (FJC), czyli łańcucha sta-
tystycznie niezależnych od siebie segmentów [12].

4. Spektrogramy mechaniczne polisacharydów

Rysunek 2 przedstawia spektrogramy mecha-

niczne AFM wyznaczone dla pojedynczych cząsteczek
różnych polisacharydów. Z wyjątkiem celulozy pozo-
stałe spektrogramy odbiegają znacznie od zależno-
ści oczekiwanych dla prostych sprężyn entropowych

(FJC). Rysunek 2a pokazuje spektrogram amylozy
(składnik skrobi), który ma przebieg zgodny z mode-
lem FJC tylko do siły ok. 100 pN. Przy sile ok. 250 pN
spektrogram ma charakterystyczne plateau, sygnalizu-
jące gwałtowny wzrost długości cząsteczki o 17–20%,
spowodowany zmianą jej konformacji. Podobne pla-
teau pojawia się przy sile ok. 800 pN w spektrogra-
mie dekstranu (polisacharyd produkowany przez bak-
terie, odpowiedzialny m.in. za tworzenie się próchnicy
zębów, rys. 2b). Spektrogram pullulanu (rys. 2c), po-
lisacharydu będącego naturalną „kombinacją liniową”
amylozy i dekstranu, wydaje się kombinacją spektro-
gramów tych cząsteczek. Amyloza, dekstran i pullulan

Rys. 2. Spektrogramy AFM rejestrują zmiany konfor-
macyjne w pierścieniu piranozy wymuszone podczas me-
chanicznego rozciągania pojedynczych cząsteczek polisa-
charydów (a–e). Szczegóły zmian konformacyjnych po-
kazano (w sposób uproszczony) we wstawkach. Długość
cząsteczek, w celach porównawczych, została znormali-
zowana poprzez podzielenie faktycznej długości polisa-

charydu przez długość zmierzoną przy sile 1500 pN.

POSTĘPY FIZYKI

TOM DODATKOWY 53D

ROK 2002

177

MATERIAŁY XXXVI ZJAZDU FIZYKÓW POLSKICH – TORUŃ 2001 – WYKŁADY SEKCYJNE

są zbudowane z cząsteczek glukozy połączonych wią-
zaniem glikozydowym, łączącym poprzez atom tlenu
atomy węgla C1 i C4 (amyloza) oraz C1 i C6 (dek-
stran). Glukoza (wstawki na rys. 2a, b i e) jest czą-
steczką o kształcie pierścienia zbudowanego z 5 ato-
mów węgla i atomu tlenu. Pierścień glukozy nie jest
płaski, lecz w stanie o najmniejszej energii ma kształt
umownie nazywany konformacją typu fotela (ang.
chair). Inną konformacją glukozy jest tzw. łódka (ang.
boat) o energii o ok. 5 kcal/mol większej niż „fotel”.
Kwantowe obliczenia odległości między sąsiednimi ato-
mami glikozydowymi tlenu w różnych konformacjach
glukozy wykazały, że skokowy wzrost długości poli-
meru odzwierciedla wymuszoną zmianę geometrii pier-
ścienia glukozy z „fotela” na „łódkę” (rys. 2a i b,
wstawki) [5]. Spektrogram pektyny, która jest polime-
rem galaktozy występującym obficie w wielu owocach
(rys. 2d) uwidacznia dwustopniowe, skokowe powięk-
szenie jej długości przy siłach ok. 300 i 900 pN. Okazuje
się, iż to dwustopniowe wydłużenie cząsteczki odzwier-
ciedla dwukrotną zmianę geometrii pierścienia galak-
tozy z „fotela” do „łódki”, a następnie do „odwróco-
nego fotela” (rys. 2d, wstawka), który ma największą
odległość atomów glikozydowych tlenu przy atomach
węgla C1 i C4 [6].

Spektrogram mechaniczny celulozy (rys. 2e) nie

wykazuje odchylenia od modelu prostej sprężyny en-
tropowej (FJC), mimo że celuloza jest również zbu-
dowana z cząsteczek glukozy połączonych wiązaniem
C1–O–C4. Zasadniczą różnicą strukturalną między
amylozą a celulozą jest to, że w amylozie wiąza-
nie glikozydowe C1–O1 jest zorientowane prostopa-
dle do pierścienia glukopiranozy (tzw. wiązanie osiowe
lub aksjalne), natomiast w celulozie wiązanie to leży
(w przybliżeniu) w płaszczyźnie pierścienia piranozy
(tzw. wiązanie równikowe lub ekwatorialne). Oblicze-
nia ab initio wykazały, że wiązania równikowe celulozy
zapewniają maksymalną odległość sąsiednich atomów
glikozydowych tlenu w podstawowej konformacji typu
„fotel” i zmiana konformacji na „łódkę” spowodowa-
łaby zbliżenie tych atomów do siebie, co jest niedopusz-
czalne podczas rozciągania cząsteczki [5]. Powyższe ob-
serwacje pozwalają sformułować tezę, iż liczba zmian
konformacyjnych zarejestrowana w spektrogramie po-
lisacharydu jest skorelowana z liczbą wiązań w orien-
tacji osiowej, przypadających na pierścień piranozy:
amyloza i dekstran mają po jednym wiązaniu osiowym
(C1–O1) i ich spektrogramy pokazują pojedyncze pla-
teau; pektyna ma dwa wiązania osiowe, gdyż w galak-
tozie wiązanie glikozydowe C1–O1 i aglikonowe C4–O4
są osiowe i dlatego spektrogram pektyny ma dwa pla-
teau; celuloza nie ma żadnych wiązań osiowych i prosty
spektrogram mechaniczny [6].

5. Spektrogramy mechaniczne agarozy

i λ-karageniny

Agaroza i λ-karagenina są liniowymi polisachary-

dami cząsteczek galaktozy [13] połączonych miesza-

nymi wiązaniami C1–O–C4 (segment a) i C1–O–C3
(segment b) – rys. 3a i b, wstawki). Polisacharydy te są
otrzymywane przez ekstrakcję z glonów. Ich chemiczna
identyfikacja oraz oczyszczanie z innych polisachary-
dów stanowi złożony proces, wymagający pracochłon-
nych zabiegów. Struktura agarozy wskazuje, że tak jak
w przypadku celulozy wszystkie wiązania są w aga-
rozie równikowe. W związku z tym oczekiwano, że

Rys. 3. Spektrogramy AFM pojedynczych cząsteczek po-
zwalają wykryć obecność obcych cząsteczek w próbkach
polisacharydów i zidentyfikować ich chemiczną struk-
turę. a) Przykładowe spektrogramy próbki agarozy. Li-
nia ciągła reprezentuje ok. 75% pomiarów. Linia krop-
kowana (frakcja X) reprezentuje ok. 25% pomiarów.
Strukturę agarozy pokazano we wstawce. b) Przykła-
dowe spektrogramy uzyskane dla pojedynczych cząste-
czek pochodzących z próbki polisacharydu λ-karageniny.
Linia ciągła reprezentuje ok. 80% przypadków. Około
20% spektrogramów ma wyraźnie inny przebieg, sy-
gnalizujący obecność w próbce obcych polisacharydów
(frakcja Y, krzyżyki). Strukturę λ-karageniny pokazano
we wstawce. c) Superpozycja spektrogramów frakcji X
z agarozy, frakcji Y z λ-karageniny i spektrogramu amy-

lozy (rys. 2a).

178

POSTĘPY FIZYKI

TOM DODATKOWY 53D

ROK 2002

MATERIAŁY XXXVI ZJAZDU FIZYKÓW POLSKICH – TORUŃ 2001 – WYKŁADY SEKCYJNE

spektrogramy mechaniczne agarozy powinny być zbli-
żone do spektrogramów celulozy (rys. 2e). Pomiary dla
pojedynczych cząsteczek z próbki agarozy dały dwie
populacje wyników: 75% spektrogramów ma przebieg
zgodny z oczekiwaniem (rys. 3a, linia ciągła reprezen-
tuje pomiar z tej grupy wyników); 25% spektrogra-
mów reprezentuje charakterystyczne zmiany konfor-
macyjne, wskazujące na występowanie przynajmniej
jednego wiązania osiowego na pierścień piranozy (przy-
kładowy spektrogram z tej grupy jest zaznaczony na
rys. 3a w postaci linii kropkowanej jako frakcja X).
Spektrogramy frakcji X nie dają się pogodzić ze struk-
turą agarozy [9]. Struktura λ-karageniny wskazuje, że
segment b ma dwa wiązania osiowe, a segment a ma
oba wiązania równikowe. Oczekiwano, iż segmenty b
ulegną zmianom konformacyjnym podczas rozciągania
cząsteczki, co powinno być widoczne w spektrogra-
mie mechanicznym. Ponadto przewidywano, iż długość
plateau odpowiadającego tym zmianom powinna być
zmniejszona np. w stosunku do spektrogramu amylozy,
gdyż tylko co drugi segment w cząsteczce λ-karageniny
powinien ulegać wydłużeniu.

Podobnie jak w przypadku agarozy, uzyskano

dwie grupy wyników [9]: 80% spektrogramów poka-
zuje krótkie plateau przy sile ok. 300 pN, odpowia-
dające dodatkowemu wydłużeniu cząsteczki o ok. 10%
(linia ciągła na rys. 3b); 20% spektrogramów ma wy-
raźnie inny przebieg, ze znacznie dłuższym plateau
i innym nachyleniem krzywej przy siłach większych
od 500 pN, wskazującym na inne właściwości sprę-
żyste w tej grupie molekuł (frakcja Y, krzyżyki na
rys. 3b). Rysunek 3c pokazuje superpozycję spektro-
gramów frakcji X agarozy i frakcji Y λ-karageniny. Na
rysunku tym naniesiono również, używając linii cią-
głej, spektrogram amylozy (por. rys. 2a). Rysunek 3c
sugeruje, iż frakcje X i Y są mechanicznie nieodróż-
nialne od amylozy, co oznacza, iż najprawdopodob-
niej frakcje te świadczą o zanieczyszczeniu próbek po-
lisacharydami typu amylozy, które zostały wyekstra-
howane razem z agarozą i λ-karageniną z macierzy-
stych organizmów i nie zostały należycie oddzielone
w procesie technologicznego oczyszczania polisacha-
rydów. Za poprawnością takiej interpretacji przema-
wiają wyniki dodatkowych pomiarów, w których ba-
dane próbki poddano utlenieniu. Utlenienie powoduje
zniszczenie pierścienia piranozy w amylozie, natomiast
nie powoduje żadnych zmian w cząsteczkach agarozy
i λ-karageniny. Wszystkie spektrogramy mechaniczne
cząsteczek pochodzących z utlenionych próbek aga-
rozy odpowiadały strukturze agarozy, co oznacza, iż
zgodnie z oczekiwaniem utlenione próbki nie zawierały
już amylozy. Podobne wyniki uzyskano dla utlenio-
nych próbek λ-karageniny [9]. Dodatkowo, niezależne
pomiary składu próbek agarozy i λ-karageniny za po-
mocą chromatografii HPLC i spektroskopii NMR [14]
wykazały, że próbki te również zawierały ok. 10% za-
nieczyszczeń glukozą pochodzącą z polisacharydu zbli-
żonego do amylozy, który spełnia funkcję skrobi w wo-

dorostach (ang. Floridean starch). Wyniki te potwier-
dzają więc całkowicie poprawność pomiarów AFM dla
pojedynczych cząsteczek.

5. Podsumowanie

Analiza strukturalna polisacharydów wymaga za-

stosowania wielu technik chemii węglowodanów, róż-
nych metod chromatografiicznych (np. HPLC) i spek-
troskopowych (NMR, CD) oraz krystalografii rentge-
nowskiej. Metody te są bardzo pracochłonne, a ich
wyniki są uśrednieniem właściwości wielkich popula-
cji cząsteczek. Spektroskopia mechaniczna polisacha-
rydów za pomocą AFM jest prostą metodą polega-
jącą na mechanicznym rozciąganiu pojedynczych czą-
steczek i rejestracji zmian konformacyjnych w pierście-
niu piranozy. Metoda ta pozwala identyfikować indy-
widualne cząsteczki w roztworze, co daje możliwość
oceny chemicznej czystości próbek biopolimerów na
nieosiągalnym dotychczas poziomie oraz pozwala na
wyznaczenie składu ich mieszanin.

Autor wyraża podziękowania Profesorom J.M. Fer-

nandezowi i A.F. Oberhauserowi oraz Doktorowi H. Li
za owocne dyskusje. Badania finansowane były z grantu
przyznanego autorowi przez National Science Foundation
(USA).

Literatura

[1] G. Binnig, C.F. Quate, C. Gerber, Phys. Rev. Lett.

56, 930 (1986).

[2] M. Rief, F. Oesterhelt, B. Heymann, H.E. Gaub,

Science 275, 1295 (1997).

[3] A.F. Oberhauser, P.E. Marszalek, H.P. Erickson,

J.M. Fernandez, Nature 393, 181 (1998).

[4] T.E. Fisher, P.E. Marszalek, J.M. Fernandez, Nat.

Struct. Biol. 7, 719 (2000).

[5] P.E. Marszalek, A.F. Oberhauser, Y.-P. Pang,

J.M. Fernandez, Nature 396, 661 (1998).

[6] P.E. Marszalek, Y.P. Pang, H. Li, J.E. Yazal,

A.F. Oberhauser, J.M. Fernandez, Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA) 96, 7894 (1999).

[7] P.E. Marszalek, H. Lu, H. Li, M. Carrion-Vazquez,

A.F. Oberhauser, K. Schulten, J.M. Fernandez, Na-
ture 402, 100 (1999).

[8] P.E. Marszalek, W.J. Greenleaf, H. Li, A.F. Oberhau-

ser, J.M. Fernandez, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 97,
6282 (2000).

[9] P.E. Marszalek, H. Li, J.M. Fernandez, Nature Bio-

technology 19, 258 (2001).

[10] M. Carrion-Vazquez, A.F. Oberhauser, S.B. Fowler,

P.E. Marszalek, S.E. Broedel, J. Clarke, J.M. Fernan-
dez, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 96, 3694 (1999).

[11] E.L. Florin i in., Biosensors and Bioelectronics 10,

895 (1995).

[12] P.J. Flory, Principles of Polymer Chemistry (Cornell

University Press, Ithaca 1953).

[13] R.L. Whistler, J.N. BeMiller, Industrial Gums. Poly-

saccharides and their derivatives (Academic Press,
San Diego 1993).

[14] C.N. Jol, T.G. Neiss, B. Penninkhof, B. Rudolph,

G.A. De Ruiter, Anal. Biochem. 268, 213 (1999).

POSTĘPY FIZYKI

TOM DODATKOWY 53D

ROK 2002

179