TEMAT 8: Analiza mikrobiologiczna wody
Literatura uzupełniająca:
A. Grabińska-Łoniewska „Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej” str. 117 – 129
Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:
Wiedzieć, jakie są przyczyny skażenia wód i dlaczego kontrolujemy ich jakość
mikrobiologiczną.
Znać poszczególne organizmy wskaźnikowe wykorzystywane w analizie mikrobiologicznej
wody i umieć scharakteryzować ich podstawowe cechy.
Znać kryteria bakteriologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia w Polsce.
Umieć oznaczyć liczebność organizmów wskaźnikowych w próbie wody i znać podstawowe
pojęcia stosowane przy określaniu zanieczyszczenia mikrobiologicznego wody (np. NPL)
Dlaczego kontrolujemy jakość sanitarną wody?
Możliwość zakażenia ludzi przez wodę zmusza do stałej kontroli higieniczno-sanitarnej, zarówno
wody przeznaczonej do picia, jak też i wody w basenach kąpielowych, a nawet w zbiornikach wód
powierzchniowych. Przyczyną zakażeń są mikroorganizmy chorobotwórcze wydalane przez ludzi
chorych i nosicieli (osobnicy, którzy po przebyciu choroby wydalają zarazki jeszcze przez długi czas
z kałem lub moczem). Zarazki występują w ściekach i w wodach powierzchniowych w znacznie
mniejszych ilościach niż pozostałe drobnoustroje. Z tego też względu znacznie trudniej jest je
wykryć niż występujące masowo w wodzie bakterie saprofityczne, tym bardziej, że w celu ich
wykrycia konieczne jest stosowanie znacznie bardziej skomplikowanych metod diagnostycznych.
Co to są mikroorganizmy wskaźnikowe?
Obowiązujące normy oparte są na pośrednim wnioskowaniu o obecności mikroorganizmów
chorobotwórczych na podstawie liczebności w wodzie bakterii wskaźnikowych, które stale żyją jako
saprofity w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt wyższych. Ich obecność w wodzie
świadczy o jej zanieczyszczeniu fekalnym, a zatem również o niebezpieczeństwie zakażenia wody
mikroorganizmami chorobotwórczymi.
Bakterie pełniące rolę wskaźników sanitarnych powinny spełniać następujące warunki:
muszą być stale obecne w przewodzie pokarmowym człowieka, co pozwala zawsze na
wykrycie kałowego zanieczyszczenia wody
do grupy organizmów wskaźnikowych powinny należeć także formy nie przetrwalnikujące,
co umożliwia wykrycie świeżego fekalnego zanieczyszczenia wody
ich identyfikacja musi być możliwa przy użyciu łatwo dostępnych metod
długość życia bakterii wskaźnikowych w środowisku zewnętrznym musi być większa niż
długość życia gatunków chorobotwórczych
liczebność bakterii wskaźnikowych w jelicie człowieka i kale powinna być duża
nie powinny się one rozmnażać w środowisku wodnym.
Jakie bakterie wskaźnikowe wykorzystywane są do oceny jakości zdrowotnej wody?
W rutynowej pracy laboratoriów, prowadzących nadzór sanitarno - epidemiologiczny, niemożliwe
jest stałe badanie wody w kierunku wykrywania wszystkich drobnoustrojów chorobotwórczych i
potencjalnie chorobotwórczych, które mogą w niej występować. Dlatego też badania rutynowe
koncentrują się przede wszystkim na wykrywaniu bakterii wskazujących na kałowe zanieczyszczenie
wody. Do oceny jakości sanitarnej wody wykorzystywana jest mikroflora saprofityczna zasiedlająca
jelito grube człowieka. Przyjęto następujące wskaźniki fekalnego zanieczyszczenia wody:
-Escherichia coli
-bakterie grupy coli,
-paciorkowce kałowe (Enterokoki),
-laseczki z rodzaju Clostridium ( Clostridium perfringens), redukujące siarczyny
oraz w niektórych przypadkach
gronkowce koagulazo-dodatnie
Pseudomonas aeruginosa
Legionella sp.
Pałeczka okrężnicy (Escherichia coli)
Fakultatywnie tlenowa, Gram-ujemna pałeczka należąca do rodziny Enterobacteriaceae.
Wchodzi w skład fizjologicznej flory bakteryjnej jelita grubego człowieka oraz zwierząt
stałocieplnych. W jelicie spełnia pożyteczną rolę, uczestnicząc w rozkładzie pokarmu, a także
przyczyniając się do produkcji witamin z grupy B, C oraz K. E. coli spotyka się również w glebie i
wodzie, gdzie trafiają z wydzielinami i kałem. Bakterie te, zwykle nieszkodliwe w jelicie, mogą
jednak powodować groźne schorzenia przewodu pokarmowego, dróg moczowych, a ostatnio często
dróg oddechowych.
Bakterie z grupy coli
Bakterie grupy coli to przede wszystkim szczepy Escherichia coli oraz drobnoustroje z rodzaju
Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella. Wykrywane są one na podłożach z laktozą po inkubacji w
temperaturze 37
o
C.
Bakterie grupy coli typu kałowego (termotolerancyjne) to głównie szczepy Escherichia coli i tylko te
nieliczne szczepy z rodzajów Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella, które mają zdolność fermentacji
laktozy w temperaturze 44
o
C.
Obecność w badanej próbce wody bakterii grupy coli lub bakterii grupy coli typu kałowego świadczy
o stosunkowo świeżym zanieczyszczeniu wody kałem, ściekami, glebą lub gnijącym materiałem
roślinnym
.
W zasadzie dla większości rodzajów wód zalecane jest oznaczanie liczby bakterii obu
grup coli.
Paciorkowce kałowe
Paciorkowce kałowe to grupa bakterii kulistych lub owalnych, występujących w postaci komórek
pojedynczych, dwoinek lub krótkich łańcuszków. Obejmuje ona drobnoustroje z rodzajów:
Enterococcus i Streptococcus należące do grupy serologicznej Lancefield D, m. in. Streptococcus
faecalis, S. faecium, S. equinus i S. bovis. Występują one powszechnie w kale ludzi i zwierząt.
Stwierdzenie obecności paciorkowców kałowych w badanej próbie świadczy o jej kontakcie z
zanieczyszczeniami typu kałowego, podobnie jak obecność bakterii grupy coli. Występowanie
enterokoków w liczbie znacznie przewyższającej liczbę bakterii grupy coli, sugerować może
zanieczyszczenie wody kałem zwierzęcym lub ściekami, pochodzącymi z ferm hodowlanych.
Paciorkowce fekalne na ogół charakteryzuje dłuższa przeżywalność w wodzie oraz większa
odporność na działanie chloru niż bakterie grupy coli.
Najważniejsze cechy charakterystyczne tej grupy bakterii to:
- zdolność wzrostu w temperaturze 45
o
C, w obecności 40% żółci oraz obecności azydku sodowego;
- zdolność wzrostu w temperaturze 10
o
C ( z wyjątkiem S. bovis i S. equinus) przy pH 9,6, w
obecności 6,5% chlorku sodowego;
- ujemny test na katalazę oraz barwienie dodatnie w metodzie Grama.
Laseczki z rodzaju Clostridium
O starym, odległym w czasie zanieczyszczeniu kałowym może świadczyć wykrycie w badanej
próbce wody bakterii redukujących siarczyny (głównie szczepy Clostridium perfringens); ich
przetrwalniki mogą zachować żywotność przez wiele lat w niesprzyjających warunkach. Clostridia
redukujące siarczyny są też bardzo dobrym wskaźnikiem prawidłowości prowadzonych procesów
uzdatniania wody, takich jak koagulacja, sedymentacja i filtracja. Przetrwalniki tych bakterii, a wraz
z nimi również cysty pasożytniczych pierwotniaków (Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia)
powinny być wyeliminowane właśnie w tych etapach uzdatniania wody, gdyż są one bardzo oporne
na działanie środków dezynfekcyjnych. Wykrycie bakterii z rodzaju Clostridium jest technicznie
znacznie bardziej proste od poszukiwania pierwotniaków pasożytniczych i daje dużą pewność, że
woda uzdatniona jest wolna od pierwotniaków i jaj robaków chorobotwórczych (helmintów).
Pseudomonas aeruginosa
Obok wymienionych elementów analizy sanitarnej proponuje się obecnie dodatkowo wykrywanie
bakterii z gatunku Pseudomonas aeruginosa w wodzie do picia i na potrzeby gospodarcze a także w
wodzie dla zakładów kąpielowych oraz w wodach powierzchniowych. Przedstawicieli tego gatunku
wyizolowano z kału ludzkiego oraz w przypadkach zakażeń organizmu – z dróg moczowych, ucha
środkowego, ropiejących ran itp. Bakterie te stanowią potencjalny czynnik chorobotwórczy dla ludzi
i zwierząt. Poza tym występują one powszechnie w wodach powierzchniowych i glebie. Warto także
podkreślić, że mogą one bytować w chlorowanej wodzie, gdyż odznaczają się znaczną odpornością
na zabiegi dezynfekcyjne.
Bakterie z rodzaju Legionella
Bakterie z rodzaju Legionella są to Gram ujemne pałeczki posiadające polarnie umieszczone wici
w liczbie od 1 do 3. Do wzrostu potrzebują żelaza i cysteiny. Ich naturalnym rezerwuarem są wody
śródlądowe i morskie. Licznie występują również w glebie i gorących źródłach wody. Wyizolowano
do tej pory 46 gatunków z rodzaju Legionella, wśród których zidentyfikowano 70 grup
serologicznych.
Bakterie
z
rodzaju
Legionella
są wewnątrzkomórkowymi pasożytami
pierwotniaków. Mogą również powodować nietypowe zapalenie płuc u ludzi, jak i gorączkę Pontiac.
Szczególnie niebezpieczne dla człowieka są bakterie należące do gatunku Legionella pneumophila.
Dostają się one do płuc w mikroaerozolach o średnicy 2,0 – 5,0 µm powstających np. w kabinach
prysznicowych. Postaci płucnej legionellozy towarzyszy suchy kaszel, zaburzenia w oddychaniu,
temperatura powyżej 40°C, zaburzenia świadomości. Śmiertelność wynosi 10-20% zachorowań.
Rezerwuarem tych bakterii są systemy ciepłej wody i urządzenia wentylacyjne. Bakterie te mogą
kolonizować wewnętrzne części rur z ciepłą wodą, zbiorniki na ciepłą wodę, wieże chłodnicze,
perlatory zaworów czerpalnych (głowice natryskowe pryszniców).
Ogólna liczebność bakterii
W badaniach rutynowych określa się również ogólną liczbę bakterii, jako liczbę jednostek
tworzących kolonie, w skrócie j.t.k.(odpowiednik angielski: cfu - colony forming units) obecnych w
1 ml wody, po wykonaniu posiewu próbki na agar odżywczy i inkubacji w temperaturach 22±2
o
C
przez 72 godz. (psychrofile), oraz w 36±2
o
C przez 24 godz
.
(mezofile).
Ogólna liczebność bakterii psychrofilnych
W niższej temperaturze rosną przede wszystkim nie chorobotwórcze bakterie wodne. Należy
jednak mieć na uwadze fakt, że Gram-ujemne bakterie wodne wytwarzają lipopolisachardy ściany
komórkowej mogące działać toksycznie – tak jak endotoksyny bakterii chorobotwórczych. Z tego
powodu ich liczba powinna być także monitorowana. Ponadnormatywny wzrost ich liczebności
świadczyć może między innymi, o obecności w wodzie łatwo przyswajalnych związków
organicznych. Teoretycznie, obecność w wodzie 0,1 mg węgla organicznego może spowodować
wzrost liczby bakterii w 1 ml do 10
8
j.t.k. (cfu). Również fosfor jest czynnikiem stymulującym
wzrost drobnoustrojów. Dodanie niewielkiej ilości tego pierwiastka (<50mg/l) powoduje nawet 10-
krotne przyspieszanie rozwoju bakterii w wodociągach.
Ogólna liczebność bakterii mezofilnych
Ze względów zdrowotnych, bardziej niebezpieczna jest ponadnormatywna liczba bakterii
rosnących w temperaturze 37
o
C, ponieważ mogą wśród nich być również bakterie chorobotwórcze.
Duża ich liczba w badanej próbce wody, może świadczyć, między innymi, o źle przebiegających
procesach uzdatniania lub zasysaniu zanieczyszczonej wody.
Co może być powodem zwiększenia ogólnej liczby bakterii w wodzie?
Zwiększenie ogólnej liczby bakterii obecnych w próbce wody może świadczyć o
namnażaniu się
drobnoustrojów na wewnętrznych powierzchniach instalacji wodnych, szczególnie na złączach rur i
uszczelkach oraz tworzeniu się warstwy tzw. biofilmu. Przekroczenie dopuszczanego poziomu
ogólnej liczby bakterii powinno być zawsze sygnałem do znalezienia przyczyny zanieczyszczenia i
do podjęcia odpowiedniego postępowania. Niekiedy może istnieć konieczność dodatkowego
chlorowania, np. wody do picia, powyżej 0,2 mg Cl
2
/l. W niektórych przypadkach dopiero zmiany
konstrukcyjne sieci wodociągowej i usunięcie biofilmu są w stanie skutecznie zabezpieczyć odbiorcę
przed wzrostem liczebności drobnoustrojów w wodzie.
Kryteria jakości sanitarnej wody do picia w Polsce.
Jakość bakteriologiczna wody do picia w Polsce oceniana jest na podstawie liczebności dwóch
grup bakterii wskaźnikowych: Escherichia coli i enterokoków (tabela 1). Dodatkowo dokonuje się
analizy bakterii z grupy coli oraz klostridiów redukujących siarczyny (tabela 2).Według stosowanych
w Polsce kryteriów w 100 ml wody podawanej do sieci wodociągowej nie może być ani jednej
komórki bakterii uznanych za wskaźnikowe. Podobne normy jakości wody obowiązują w Unii
Europejskiej. Dodatkowym ważnym kryterium jakości wody do picia jest także ogólna liczebność
bakterii psychrofilnych i mezofilnych w 1 ml wody. Według stosowanych w Polsce kryteriów w
wodzie do spożycia przez ludzi liczebność bakterii psychrofilnych nie powinna przekraczać 100
komórek w 1ml, natomiast bakterii mezofilnych 50
komórek w 1 ml wody (tabela 2).
Osobne wymagania dotyczą wód wprowadzanych do jednostkowych opakowań (tabela 3) oraz
wód w cysternach, zbiornikach magazynujących wodę w środkach transportu lądowego,
powietrznego lub wodnego (tabela 4). Jakość wody ciepłej ocenia się na podstawie liczebności
bakterii z rodzaju Legionella (tabela 5).
Tabela 1. Podstawowe wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia
Lp.
Parametr
Najwyższa dopuszczalna wartość
Liczba
mikroorganizmów
[jtk]
Objętość próbki
[ml]
1
Escherichia coli
0
100
2
Enterokoki
0
100
Tabela 2. Dodatkowe wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia
Lp.
Parametr
Najwyższa dopuszczalna wartość parametru
w próbce wody
Liczba
mikroorganizmów
[jtk]
Objętość próbki
[ml]
1
Bakterie grupy coli
1
0
100
4
Ogółna liczba mikroorganizmów
w 36±2
o
C po 48 h
50
1
Ogółna liczba mikroorganizmów
w 22±2
o
C po 72 h
100
1
5
Clostridium perfringens
2
0
100
Tabela 3. Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda wprowadzana do
opakowań jednostkowych.
Lp.
Parametr
Najwyższa dopuszczalna wartość
Liczba
mikroorganizmów
[jtk]
Objętość próbki
[ml]
1
Escherichia coli
0
250
2
Enterokoki
0
250
3
Pseudomonas aeruginosa
0
250
4
Ogółna liczba mikroorganizmów
w 36±2
o
C po 48 h
20
1
5
Ogółna liczba mikroorganizmów
w 22±2
o
C po 72 h
100
1
1
Dopuszcza się pojedyncze bakterie wykrywane sporadycznie
2
Należy badać w wodzie pochodzącej z ujęć powierzchniowych i mieszanych, a w przypadku przekroczenia
dopuszczalnych wartości, należy zbadać czy nie ma zagrożenia zdrowia ludzkiego wynikającego z obecności innych
mikroorganizmów chorobotwórczych, np. Cryptosporidium.
Tabela 4. Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda w cysternach,
zbiornikach magazynujących wodę w środkach transportu lądowego, powietrznego lub wodnego.
Lp.
Parametr
Najwyższa dopuszczalna wartość parametru
w próbce wody pobranej
Liczba
mikroorganizmów
[jtk]
Objętość próbki
[ml]
1
Escherichia coli
0
100
2
Enterokoki
0
100
3
Pseudomonas aeruginosa
0
100
4
Ogółna liczba mikroorganizmów
w 36±2
o
C po 48 h
100
1
Tabela 5. Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać ciepła woda użytkowa
Lp.
Parametr
Najwyższa dopuszczalna wartość
Liczba
mikroorganizmów
[jtk]
Objętość próbki
[ml]
1
Legionella sp.
3
<100
100
3
Należy badać w ciepłej wodzie w budynkach zamieszkania zbiorowego i zakładach opieki zdrowotnej zamkniętej
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
Zadanie1. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą filtrów membranowych (FM)
Metodę tę stosuje się do wykrywania bakterii grupy coli w wodzie wodociągowej uzdatnionej i
nieuzdatnionej. Metody nie należy stosować do oznaczania liczby bakterii coli w wodach
powierzchniowych o mętności wyższej niż 20 mg SiO
2
/dm
3
, przy równocześnie niskiej liczbie
bakterii grupy coli, tj. poniżej 10 kolonii w 100 cm
3
wody, a wysokiej liczbie (powyżej 100
komórek/cm
3
) bakterii wodnych mogących rozwinąć się również na zastosowanym podłożu. Metoda
ta nie nadaje się do oznaczania liczby bakteri coli w ściekach. W tych przypadkach należy wykonać
oznaczenia metodą fermentacyjno-probówkową (FP).
Zasada metody:
Oznaczanie liczby bakterii grupy coli metodą filtrów membranowych przez określenie tzw. wskaźnika
coli jako wyniku ostatecznego polega na przesączeniu przez filtr membranowy odpowiednio dobranej
objętości próbki wody. Bakterie zatrzymane na filtrze umieszczonym następnie na pożywce wybiórczej
dyfundującej przez pory filtru, rozwijają się w czasie inkubacji, tworząc kolonie o typowym wyglądzie.
Założono, że z jednej komórki bakteryjnej rozwija się jedna kolonia. Przez obliczenie typowych kolonii
bakterii należących do grupy coli określa się następnie wskaźnik coli jako liczbę komórek bakterii grupy
coli w 100 cm
3
próbki wody.
Objętość próbki nie powinna być mniejsza niż 250 cm
3
. Przed użyciem aparat filtracyjny należy
wysterylizować w autoklawie w temp. 120
o
C przez 15 min. Filtry membranowe (o średnicy ok. 50 mm i
przeciętnej średnicy porów 0,45 μm) wysterylizować w przez dwukrotne wygotowanie w wodzie
destylowanej, każdorazowo zmienianej – w ciągu 20 min.
Sposób postępowania:
1. Zmontować aparat filtracyjny. W tym celu lejek umieścić w kolbie ssawkowej, połączonej z pompą
próżniową. Przy zamkniętym kranie aparatu nałożyć pincetą (wyjałowioną przez opalanie) filtr
membranowy na porowatą płytkę, błyszczącą względnie kratkowaną stroną do góry,
2. Wlać odpowiednią ilość badanej wody do lejka, otworzyć kran i przefiltrować próbkę. Objetość próbki
użytej do filtracji powinna wynosić odpowiednio:
- dla wody wodociągowej - 200 cm
3
;
-dla wody powierzchniowej i wody z basenu kąpielowego – 1 i 0,1 cm
3
;
Całkowita objętość filtrowanej wody nie powinna być mniejsza niż 20 cm
3
.
3. Po przefiltrowaniu, ściany lejka spłukać dokładnie jałową wodą buforowaną;
4. Zamknąć kran i wyjałowioną pincetą przenieść filtr membranowy na powierzchnię podłoża agarowego
Endo FM. Filtr powinien być położony do góry zawiesiną bakteryjną tak, aby nie było pęcherzyków
powietrza pomiędzy filtrem a podłożem;
5. Płytki Petriego z filtrami umieścić w cieplarce dnem ku górze i inkubować w temp. 37
o
C w ciągu 20
godz. Okres inkubacji należy przedłużyć do 48 godz. w przypadku braku wzrostu po 20 godzinach
lub wzrostu nielicznych, nietypowych kolonii.
6. Po inkubacji policzyć wyrosłe kolonie typowe, tj. ciemnoczerwone z metalicznym, połyskiem
(tzw. połysk fuksynowy).
Do liczenia należy wybrać filtry, na których jest od 20 do 80 kolonii typowych, a ogólna liczba kolonii
nie przekracza 200. Jeśli po 20 godz. nie stwierdza się obecności typowych kolonii, natomiast wyrosły
kolonie czerwone, różowe z ciemnym środkiem i różowe, należy przeprowadzić badanie potwierdzające.
Badania te należy również zastosować przy pojawieniu się kolonii z metalicznym połyskiem po
przedłużonym okresie inkubacji. W tym celu od 3-6 kolonii z filtrów należy przeszczepić na podłoże
laktozowe z purpurą bromokrezolowąi inkubować w temp. 37
o
C w ciągu 24-48 godz. Pojawienie się gazu
w rurce Durhama oraz zmiana zabarwienia podłoża na żółte świadczy o dodatnim wyniku badania
potwierdzającego. W przypadku ujemnego wyniku na podłożu laktozowym, należy przeprowadzić badanie
potwierdzające, jak w etapie II metody fermentacyjno-probówkowej (FP).
Zadanie 2. Oznaczanie Escherichia coli (bakterii grupy coli typu kałowego)
metodą filtrów membranowych (FM)
Badanie wstępne wykonać zgodnie z metodyką podaną przy oznaczaniu bakterii grupy coli (zadanie 1).
Inkubację hodowli na podłożu agarowym Endo FM prowadzić w temp. 44
o
C przez 24 godz.;
W razie konieczności wykonania badania potwierdzającego, materiał z kolonii należy wyizolować na
skos agarowy, a nastepnie wykonac barwienie metodą Grama oraz sprawdzić zdolność do wytwarzania
oksydazy cytochromowej i fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu na pożywce ze
wskaźnikiem Andrade lub na pożywce z zielenią brylantową w temp.44
o
C w ciągu 24 godz.
Obliczanie wyniku oznaczania
Wynik badania należy podać w jednostkach tworzących kolonie (jtk)/ 100 cm
3
(wskaźnik coli)
korzystając ze wzoru:
X = a x 100/V
gdzie: X – wskaźnik coli,
a – liczba typowych kolonii,
V – objętość filtrowanej wody [cm
3
].
Ostateczny wynik stanowi średnią arytmetyczną, z co najmniej dwóch filtracji różnych objętości
wody. Na podstawie wartości wskaźnika można obliczyć miano coli lub miano coli typu kałowego
(E. coli) wg wzoru:
miano coli = 100/X
gdzie: X – wskaźnik coli
Zadanie 3. Oznaczanie paciorkowców kałowych (Streptococcus faecalis)
metodą filtrów membranowych (FM)
Metodę FM do oznaczania paciorkowców kałowych stosuje się do wszystkich wód, z wyjątkiem
wód o dużej zawartości zawiesiny.
Oznaczenie paciorkowców kałowych polega na przesączeniu określonej objętości próbki przez
filtr membranowy i przeniesieniu filtru z bakteriami na pożywkę Slanetza i Bartleya (SB) z azydkiem
sodu. Paciorkowce rozwijają się na tej pożywce tworząc charakterystyczne kolonie zabarwione na
kolor czerwony i różowy;
Postępowanie:
1. Przefiltrować wodę jakw zadaniu 1 i 2
2. Po filtracji (warunki sterylne), jałową pincetą przenieśc filtr membranowy na pożywkę SB
i wstawić do cieplarki o temperaturze 37
o
C na 48 h
3. Po inkubacji policzyć wyrosłe kolonie. Ze względu na niewielkie rozmiary kolonii (0,2 do 1 mm
średnicy), zaleca się liczyć je pod lupą. Liczba wyrosłych kolonii nie powinna być większa niż 100
i nie mniejsza niż 20, dlatego zaleca się wykonanie rozcieńczeń badanej próbki.
Obliczanie wyniku oznaczania:
liczbę paciorkowców kałowych (X) obliczyć wg wzoru:
X = a x 100/V
a – liczba typowych kolonii na pożywce SB,
V – objętość filtrowanej wody [cm
3
]
Wynik należy podać jako jtk /100 cm
3
próbki
Zadanie 4. Oznaczanie liczby bakterii psychrofilnych i mezofilnych
1. Oznaczanie wykonać metodą płytkową Kocha, stosując posiew wgłębny na podłoże agarowe
odżywcze. Posiewy wody wodociągowej wykonać z prób nierozcieńczonych (1 cm
3
) oraz z
rozcieńczenia 10
-1
(1 cm
3
);
2. Inkubację bakterii psychrofilnych prowadzić w temp. 20
o
C w ciągu 72 godzin, a mezofilnych –
w temp. 37
o
C przez 24 h;
3. Po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie. Do określenia liczby kolonii, przy posiewie
wody powierzchniowej i ścieków, wybrać płytki,na których wyrosło od 30 – 300 kolonii. W
przypadku, gdy liczba kolonii wyrosłych na płytce jest większa niż 300 oznaczenie należy wykonać
ponownie. Licząc kolonie z próby rozcieńczonej, należy liczbę koloni pomnożyć przez krotność
rozcieńczenia;
4. Wynik oznaczenia podać jako jtk/1 cm
3
Zadanie 5. Oznaczanie NPL
i miana
bakterii z grupy coli metodą fermentacyjno-probówkową (FP)
Określenia:
bakterie grupy coli – Gram – ujemne pałeczki nie wytwarzające przetrwalników, rozwijające się
w warunkach wzglądnie beztlenowych, mające zdolność fermentowania laktozy z wytworzeniem
kwasu i gazu w ciągu 48 h hodowania w temperaturze 37
o
C. Należą one do rodzaju Escherichia,
Citrobacter i Enetrobacter w obrębie rodziny Enterobacteriaceae;
najbardziej prawdopodobna liczba bakterii grupy coli (NPL) – liczba bakterii grupy coli w 100
cm
3
badanej próbki wody lub ścieków określona (z tablic) na podstawie rachunku
prawdopodobieństwa;
miano coli – najmniejsza objętość badanej wody lub ścieków, wyrażona w cm
3
, w której
stwierdza się jeszcze obecność bakterii grupy coli;
wynik dodatni fałszywy - wytworzenie kwasu i gazu w pożywce płynnej z laktozą na drodze
fermentacji laktozy, wywołanej przez bakterie nie należące do grupy coli (ani do
Enterobacteriaceae), mianowicie przez Gram – dodatnie, wytwarzające prztrwalniki laseczki z
rodzaju Bacillus lub przez Gram – ujemne, niewytwarzające przetrwalników pałeczki rodzaju
Aeromonas, lub w rezultacie synergizmu bakteryjnego.
Wykrywanie bakterii grupy coli matodą fermentacyjno – probówkową (FP) oparte jest na
zdolności tych bakterii do fermentowania laktozy z wytworzeniem w podłożu kwasu oraz
widocznego gazu.
Metoda obejmuje badanie wtępne, w którym na podstawie wytworzonego w podłożu kwasu i
gazu w ciagu 24 h lub 48 h inkubacji w temperaturze 37
o
C, wnioskuje się o obecności bakterii z
grupy coli (dodatni wynik badania wstępnego) oraz badania potwierdzające, mające na celu
wykluczenie fałszywych dodatnich wyników badania wstępnego przez stwierdzenie, że bakterie
fermentujące laktozę w badaniu wstępnym rzeczywiście należą do grupy coli. Po wykonaniu badania
określa się ostateczny wynik w postaci najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) bakterii grupy coli
w 100 cm
3
próbki lub miana coli korzystając ze specjalnych tablic statystycznych.
Etap I – Badanie wstępne.
Polega ono na posiewie na podłoże płynne z laktozą i purpurą bromokrezolową (podłoże LPB,
podłoże Eijkamana) i inkubacji w temperaturze 37
o
C przez 48 h. Przed posiewem należy sprawdzić
probówki (butelki) z pożywką i odrzucić te, w których stwierdza się obecność pęcherzyka powietrza
w probówce Durhama. Wszystkie naczynia z pożywką należy odpowiednio oznakować, podając nr.
probówki, datę i ewentualną posiewaną objętość próbki.
Objętość posiewanej próbki uzależniona jest od jej rodzaju, celu badania i wymagań sanitarnych.
Tabela 6. System posiewu próbek wody
Dopuszczalna liczba bakterii
grupy coli w 100 cm
3
próbki (NPL)
Objętość posiewanej wody
1
2
10
1 x 50 cm
3
i 5 x 10 cm
3
5 x 10 cm
3
, 1 x 1 cm
3
, 1 x 0,1 cm
3
2 x 10 cm
3
, 2 x 1 cm
3
, 2 x 0,1 cm
3
W przypadku spodziewanego większego zanieczyszczenia wody, należy dodatkowo posiać
odpowiednio mniejsze jej objętości, niż w podanym zestawieniu.
Z uwagi na powyższe zależności, należy zastosować następujący sysytem posiewów (tab.7):
Tabela 7. System posiewu próbek wody
Rodzaj próbki
System posiewów
woda z wodociągów sieciowych
dezynfekowana
1 x 50 cm
3
, 5 x 10 cm
3
woda z wodociągów sieciowych nie
5 x 10 cm
3
, 1 x 1 cm
3
,
dezynfekowana, woda z basenu kąpielowego 1 x 0,1 cm
3
(rozc. 10
-1
)
woda z urządzeń na potrzeby własne
2 x 10 cm
3
, 2 x 1 cm
3
, 2 x 0,1 cm
3
woda powierzchniowa i ścieki po
biologicznym oczyszczaniu
2 x 0,1 cm
3
– 0,0001 cm
3
(rozc. 10
-1
– 10
-4
)
posiewy 10 i 50 cm
3
nie rozcieńczonej próbki wody należy wykonać na podłoże LPB o stężeniu
podwójnym, wszystkie inne objętości, tj. 1 cm
3
oraz po 1 cm
3
z rozcieńczeń od 10
-1
do 10
-4
– na
podłoże o stężeniu normalnym;
posiane próbki inkubować w temp. 37
o
C w ciągu 24-48 h;
za wynik dodatni przyjmuje się obecność gazu w rurkach Durhama lub występowanie
pęcherzyków gazu w podłożu, przy lekkim wstrząsaniu, oraz zmętnienie i zmianę barwy z
fioletowej na żółtą. Zmiany te wskazują na wzrost bakterii i fermentację laktozy z wytworzniem
kwasu i gazu. Jeśli po 18 – 24 h hodowli nie występują zmiany dodatnie próbki, inkubować dalej
i wyniki odczytać ponownie po 48 h. Brak gazu i zakwaszenia po 48 h inkubacji przyjmuje się
jako wynik ujemny. Obećność niewielkich ilości gazu przy słabym zakwaszeniu lub jego braku,
uznaje się za wątpliwy, wymagający dalszego potwierdzenia.
Etap II – Badanie potwierdzające
Badanie to wykonuje się w celu potwierdzenia obecności bakterii grupy coli, w zasadzie z
wszystkich dodatnich i wątpliwych hodowli badania wstępnego, uzyskanych po 24 lub 48 h. Badania
potwierdzające mają także na celu wykluczenie tzw. wyników dodatnich fałszywych.
Badania potwierdzające obecność bakterii grupy coli wykonuje się na pożywce Endo.
1. Posiać metodą powierzchniową za pomocą ezy niewielką ilość zawiesiny z 24- lub 48-
godzinnej hodowli bakterii na podłożu (LPB) na podsuszone podłoże Endo;
2. Inkubować hodowlę w temp. 37
o
C w ciągu 24 h;
Za wynik dodatni przyjmuje się wzrost koloni gładkich, ciemnoczerwonych z
charakterystycznym metalicznym połyskiem (fuksynowym). W podłożu Endo, w obecności
siarczynu sodu, laktoza i fuksyna tworzą leukozwiązek. W wyniku wzrostu bakterii
wykorzystujących laktozę następuje uwalnianie fuksyny do podłoża, która barwi charakterystycznie
bakterie wystepujące w kolonii. W przypadku obecności choćby jednej takiej kolonii, wynik badania
potwierdzającego należy uznać za dodatni. Niektóre szczepy bakterii grupy coli rosną na podłożu
Endo w postaci gładkich, jasno- lub ciemnoróżowych koloni bez charakterystycznego połysku. Są to
kolonie nietypowe. Obecność na płytce wyłącznie kolonii nietypowych uznaje się za wynik
wątpliwy, wymagający uzupełniającego badania potwierdzającego. Wzrost innych kolonii uznaje się
za wynik ujemny.
Etap III – Badanie uzupełnijące
Jest to dalszy etap badania potwierdzającego i stosuje się je w przypadku, gdy na pożywce Endo
wyrosną nietypowe bakterie, podejrzane o przynależność do grupy coli. Badania obejmują:
określenie zdolności wyizolowanego szczepu do fermentacji laktozy z wytworzeniem kwasu i
gazu (tzw. wtórna fermentacja laktozy);
wykonanie barwienia metodą Grama;
obserwacje mikroskopowe;
wykonanie testu na obecność oksydazy cytochromowej.
W celu wykonania badań uzupełniających należy:
1. Wybrać z hodowli na podłożu Endo kilka kolonii nietypowych i każdą posiać na podłoże
laktozowe ze wskaźnikiem Andrade i na powierzchnię skosu z podłoża agarowego (MPA).
2. Hodowle inkubować w temp. 37
o
C w ciągu 24-48 h;
Za wynik dodatni fermentacji laktozy przyjmuje się zakwaszenie podłoża obrazowane
zabarwieniem różowym i obecność gazu w rurkach Durhama. Brak tych zmian jest wynikiem
ujemnym badań uzupełniających;
barwienie metodą Grama wykonać zgodnie z metodyką, z 24-godzinnych hodowli bakterii na
skosie agarowym. Za wynik dodatni przyjąć obecność w preparacie pałeczek Gram (-);
test na obecność oksydazy cytochromowej wykonać z zastosowaniem 24-godzinnej hodowli
bakterii na skosie agarowym, według metodyki. Za wynik dodatni testu przyjąć brak oksydazy
cytochromowej.
Oliczanie NPL wg. tablicy statystycznej (będzie dostępna na ćwiczeniach, są też zamieszczone
np. w Ćwiczeniach laboratoryjnych z mikrobiologii ogólnej A. Grabińskiej-Łoniewskiej).
W przypadku posiewania mniejszych objętości próbki niż podano w tej tablicy, z posianych
objętości wybiera się trzy objętości stanowiące podstawę dla obliczenia NPL (przy zastosowaniu
dwuprobówkowego systemu posiewów). Przy obliczaniu wartości NPL stosuje się następujące
zasady:
jeśli zamiast 10, 1 i 0,1 cm
3
posiewa się 1, 0,1 i 0,01 cm
3
, otrzymany wynik z tabeli należy
zwiekszyć dziesięciokrotnie;
jeśli zamiast 10 i 0,1 cm
3
posiewa się 0,1, 0,01 i 0,001 cm
3
, wynik należy zwiększyć
stukrotnie, itd.;
jeżeli posiewa się więcej niż trzy różne objętości próbki w rozcieńczeniach
dziesięciokrotnych (np. wody powierzchniowe, ścieki), tylko wyniki z trzech wybranych
objętości stanowią podstawę do obliczenia NPL.
wybór odpowiednich objętości opiera się na zasadzie : jako pierwszą najwiekszą objętość,
należy wybrać taką, w której występują tylko wyniki dodatnie przeprowadzonego badania i
powyżej której również występuja wyniki dodatnie, pozostałe dwie objętości, to dwa
następne, kolejne rozcieńczenia próbki;
do określenia miana coli w przypadku posiewania wiecej niż trzech objętości próbki lub
mniejszych objętości niż podano w tabeli, należy posługiwać się również tą samą tablicą w
sposób analogiczny jak przy określaniu NPL z tym, że wyniki miana otrzymane z tabeli
należy zmniejszyć, np. jeśli zamiast 10, 1 i 0,1 cm
3
, posiewa się 1, 0,1 i 0,001 cm
3
, odczytaną
wartość miana należy dziesięciokrotnie zmniejszyć.
Zadanie 6. Oznaczenie NPL i miana Escherichia coli (bakterii grupy coli typu kałowego)
metodą fermentacyjno probówkową (FP)
Metodę fermentacyjno probówkową oznaczenia bakterii grupy coli typu kałowego
(fekalnego) stosuje się do badania każdego rodzaju wody i ścieków w przypadku, gdy zachodzi
potrzeba stwierdzenia świeżego kałowego (ściekowego) zanieczyszczenia. Metoda ma
szczególne zastosowanie do badań wód mętnych o małej liczbie poszukiwanych bakterii oraz
chlorowanych ścieków.
Bakterie grupy coli typu kałowego (fekalnego) są to bakterie z grupy coli, które poza
wszystkimi właściwościami tej grupy (pałeczki Gram-ujemne, oksydazoujemne, nie
wytwarzające przetrwalników, względnie beztlenowe, fermentujące laktozę w zasadzie z
wytworzeniem kwasu i gazu w temp.37
o
C w ciągu 48 h oraz dające charakterystyczne kolonie na
pożywce Endo), mają ponadto zdolność wzrostu oraz przeprowadzania niektórych procesów
biochemicznych, a wszczególności fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu
również w temperaturze 44
o
C.
Większość tych bakterii w wodach i ściekach to Escherichia coli (E. coli) występująca
praktycznie zawsze w kale ludzkim przekraczając znacznie liczbę innych bakterii grupy coli.
Dzięki temu E.coli uważana jest za typowo kałowy gatunek baketrii grupy coli.
E. coli poza właściwościami bakterii grupy coli typu kałowego ma ponadto zdolność do:
wytwarzania indolu w wodzie peptonowej z tryptofanem (I), daje pozytywną reakcję z czerwienią
metylową na podłożu wg Clarka (M.), nie wytwarza acetylometylokarbinolu z glukozy na
podłożu wg Clarka (V) oraz nie ma zdolności wzrostu na podłożu wg Simmonsa, zawierającym
cytrynian sodowy jako jedyne organiczne źródło węgla (C). Wymienione cztery cechy określa się
testami biochemicznymi, znanymi jako tzw. szereg IMVC, służącymi do identyfikacji E.coli.
Zasada metody:
Wykrywanie bakterii grupy coli typu kałowego metodą fermentacyjno-probówkową (FP)
oparte jest na zdolności tych bakterii fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu w
temp. 44
o
C. Metoda ta obejmuje badanie wstępne, w którym na podstawie wytworzonego w
pożywce namnażającej kwasu i gazu w temp. 37
o
C w ciągu 24-48 h wnioskuje się o obecności
bakterii grupy coli oraz badanie potwierdzające, które ma na celu stwierdzenie, czy bakterie
fermentujące laktozę w badaniu wstępnym należą do grupy coli typu kałowego.
W przypadku konieczności zidentyfikowania tych bakterii jako E.coli, należy wykonać
dodatkowo badania wg szeregu IMViC lub zastosować szybki test w temp. 44
o
C.
Etap I – Badania wstępne - Badania przeprowadza się, jak w przypadku bakterii grupy coli
Etap II – Badania potwierdzające – Badaniu potwierdzającemu poddaje się materiał pochodzący
ze wszystkich dodatnich i wątpliwych hodowli z badania wstępnego, przy oznaczaniu bakterii z
grupy coli metodą FP. W tym celu należy:
zawiesinę bakterii z hodowli na podłożu LPB przenieść ezą na podłoże laktozowe z zielenią
brylantową i inkubować w temp. 44
o
C w ciągu 18-24 h;
za wynik dodatni przyjmuje się zmętnienie podłoża oraz obecność gazu w rurkach Durhama lub
w całej objętości podłoża przy lekkim wstrząśnięciu. Równolegle z badaniami potwierdzającymi
na pożywce z zielenią brylantową w temp. 44
o
C, wskazane jest przeprowadzenie badania
potwierdzającego na podłożu Endo, jak podano w metodyce oznaczania bakterii grupy coli
metodą FP.
Etap III – Badania identyfikujące Escherichia coli. Identyfikację Escherichia coli przeprowadzać
można dwiema metodami: metodą szeregu IMViC oraz tzw. testu szybkiego.
Metoda szeregu IMViC. Materiał z próbek dodatnich uzyskanych po hodowli bakterii na podłożu
z laktozą i z zielenią brylantową przenieść na podłoże Endo. Wyrosłe na podłożu Endo
pojedyncze typowe kolonie poddaje się identyfiakcji wg szeregu IMViC, w którym oznacza się
zdolność do:
wytwarzania indolu z tryptofanu na podłożu z wodą peptonową z tryptofanem (I);
rozkładu glukozy do kwasu (reakcja z czerwienią metylową) na podłożu wg Clarka (M);
wytwarzania acetylometylokarbinolu z glukozy (reakcja Voges-Proskauera) na podłożu wg
Clarka (VP);
wykorzystywania cytrynianu jako jedynego źródła węgla na podłożu Simmonsa (C);
Wytwarzanie indolu – sprawdza się po 24 h inkubacji, dodając do hodowli, po ściance probówki,
kilka kropli odczynnika Ehrlicha lub odczynnika Kovacsa. Pojawienie się po chwili czerwonego
zabarwienia na granicy płynów świadczy o obecności indolu, co określa się jako wynik dodatni (+);
Reakcja z czerwienią metylową – wykonuje się dodając do 3-4-dniowej hodowli na podłożu
Clarka, 2 krople czerwieni metylowej. Wystąpienie wyraźnie czerwonej barwy wskazuje na
zakwaszenie pożywki i świadczy o dodatnim wyniku tej reakcji (+). Kolor żółty określa się jako
wynik ujemny (-), kolor pomarańczowy lub bardzo jasnoczerwony – jako wynik wątpliwy (?);
Reakcja Voges-Proskauera stwierdzająca obecność acetylometylokarbinolu (V) – wykonuje się
po 24 h hodowania, dodając do hodowli 0,6 cm
3
r-ru α-naftolu i po dokładnym wymieszaniu 0,4 cm
3
r-ru wodorotlenku potasowego. Zawartość probówki miesza się ponownie i wstawia do termostatu o
temp. 37
o
C na 30-45 min. Wystąpienie po tym czasie intensywnego różowego lub czerwonego
zabarwienia w górnej części płynu oznacza wynik dodatni (+), tzn. że w pożywce obecny jest
acetylometylokarbinol. W przypadku wyniku ujemnego (-), pożywka nie zmienia barwy lub daje
lekko różowe zabarwienie;
Zdolność wykorzystania cytrynianu jako jedynego źródła węgla (C ) na podłożu Simmonsa przy
hodowli w temp. 44
o
C w ciągu 72 h, brak zabarwienia określa się jako wynik ujemny (-),
charakterystyczny dla E. coli. Wzrost innych pałeczek z grupy coli powoduje alkalizacje podłoża i
zmianę jej zabarwienia z zielonej na niebieską, co określa się jako wynik dodatni (+).
Typowe szczepy E.coli charakteryzują się następującymi wynikami szeregu IMViC: ++--;
wyjątkjowo zdarzają się indoloujemne szczepy E.coli i wtedy wynik szeregu IMViC przedstawia
się następująco: -+--. Według szeregu IMViC identyfikuje się w sposób pewny tylko te bakterie z
grupy coli, które fermentują laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w 44
o
C.
Metoda tzw. testu szybkiego
materiał z każdej dodatniej i wątpliwej hodowli na podłożu LPB posiać na podłoże z zielenią
brylantową i na wodę peptonową z tryptofanem;
próbki inkubować w temp. 44
o
C przez 24 h. Wyniki dodatnie obu reakcji, z dużym
prawdopodobieństwem, świadczą o obecności E.coli, ponieważ są one w zasadzie jedynymi
bakteriami z rodziny Enterobacteriaceae, które fermentują laktozę z wytworzeniem gazu i
wytwarzają indol w temp. 44
o
C.
Wynik oznaczenia bakterii z grupy coli podać jako NPL w 100 cm
3
i miano bakterii grupy coli i
bakterii coli typu kałowego (Escherichia coli). Wyniki należy podawać w natępujący sposób:
NPL bakterii gupy coli w 100 cm
3
.
Ćwiczenie 7. Oznaczanie beztlenowych bakterii przetrwalnikujących redukujących siarczyny
(Clostridium) metodą hodowli na pożywce płynnej
Metodę stosuje się do wykrywania bakterii beztlenowych przetrwalnikujących, redukujących
siarczyny (Clostridium) w wodzie i ściekach. Bakterie przetrwalnikujące, redukujące siarczyny
należą do rodziny Bacillaceae, rodzaju Clostridium. Rozwijają się w warunkach beztlenowych i są
Gram-dodatnie. Na ogół bakterie z tej grupy powszechnie występują w glebie, wodzie, ściekach, kale
ludzkim i niektórych zwierząt. Dzięki zdolności wytwarzania przetrwalników są oporne na działanie
chloru i innych związków dezynfekcyjnych.
Metoda polega na posianiu odpowiedniej objętości próbki wody lub ścieków na pożywkę płynną
(np. 1x 50 cm
3
i 5x10 cm
3
). W wyniku wytrącającego się siarczku żelaza pod wpływem
rozwijających się bakterii pożywka barwi się na kolor od szarego do smolistoczarnego.
Wykonanie:
1. Przed przystąpieniem do oznaczenia należy zniszczyć obecne w probówce formy wegetatywne
bakterii. W tym celu należy próbki z pożywką należy ogrzać do temperatury 80
o
C w łaźni wodnej i
przetrzymać w tej temperaturze ok.20 min., licząc czas od osiągnięcia tej temperatury w próbce.
2. Po tym czasie próbkę należy ochłodzić i dodać w sposób jałowy odpowiednią ilość cyrynianu
żelazowego i roztworu siarczynu sodu. W celu odcięcia dostępu powietrza do pożywki dodać
odpowiednią objętość jałowej płynnej parafiny, aby tworzyła nad pożywką ok. 1,5 – centymetrową
warstwę;
3. Posiane próbki inkubować w cieplarce, w temperaturze 37
o
C przez 24-48 h;
Beztlenowe bakterie przetrwalnikujące, redukujące siarczyny, rozwijające się pożywce zmieniają
jej barwę od szarej do czarnej. Wszystkie próbki o zmienionej barwie pożywki od szarej do czarnej
należy uznać za dodatnie.
Wyniki należy podać w postaci NPL beztlenowych przetrwalnikujących bakterii redukujących
siarczyny (Clostridium).