1

LABORATORIUM 2.

Temat: OTRZYMYWANIE WYBRANYCH PREPARATÓW

BIOCHEMICZNYCH.

Zadanie 1. Krystaliczna albumina jaja.

Wykonanie:

· Białko 1 jaja po oddzieleniu od żółtka umieścić w plastikowym cylindrze miarowym

(w celu zmierzenia objętości) i przelać do plastikowego pojemniczka (zlewka nr1),

- w innym plastikowym cylindrze miarowym odmierzyć taką samą objętość

nasyconego roztworu siarczanu amonu i dodać do zlewki nr 1wlewając go cienkim
strumieniem równocześnie mieszając szklaną bagietką. Zamknąć pojemnik i
wymieszać.

· Wypada osad globulin, który należy odsączyć na miękkim, bibułowym sączku

fałdowanym zbierając przesącz do szklanego cylindra miarowego.

· Zmierzyć za pomocą szklanego cylindra miarowego objętość przesączu i przelać go do

plastikowego pojemniczka (zlewka nr 2).

- dodać na każde 100 ml. przesączu 14,4 g drobno sproszkowanego siarczanu

amonowego (UWAGA ! - 1 płaska łyżeczka to ok. 1,44 g siarczanu amonu).
Siarczan amonowy dodawać małymi porcjami stale mieszając bagietką. Powstaje osad.

· Powstały osad przesączyć do kolbki ssawkowej przez miękki sączek, korzystając z

lejka Büchnera i pompy wodnej.

· Osad zebrać z sączka za pomocą plastikowej łyżeczki do zlewki szklanej (szklanej

probówki),

- rozpuścić w możliwie małej objętości wody
- i roztwór doprowadzić do pH 4,7 za pomocą 4 % kwasu octowego korzystając z pH-

metru, stale mieszając.

· Roztwór przesączyć do kolbki ssawkowej przez miękki sączek, korzystając z lejka

Büchnera i pompy wodnej.

· Przelać przesącz do plastikowego pojemniczka (zlewki nr 3 – „albumina”),
- do klarownego przesączu dodać przy stałym mieszaniu pojedynczymi kroplami

nasycony roztwór siarczanu amonowego aż do powstania trwałego, delikatnego
zmętnienia.

· Próbę pozostawić w lodówce. W ciągu 2 dni wypadają z zawiesiny kryształy albuminy

jaja w formie igieł.

Wypreparowane białko posłuży do realizacji dalszych ćwiczeń.

Zadanie 2. Izolowanie glikogenu z wątroby - metoda Osterna

Wykonanie:

·

Wątrobę (25 g) pociąć za pomocą nożyczek na drobne kawałki,

-

rozetrzeć w moździerzu z 1 łyżeczką piasku, czyli homogenizować (piasek

dodawać porcjami).

2

·

Odmierzyć do plastikowego cylindra miarowego 10 ml. homogenatu.

-

do innego plastikowego cylindra miarowego odmierzyć10 objętości

(czyli100 ml.) 5 % kwasu trójchlorooctowego,

-

przelać homogenat i kwas do plastikowego pojemnika (zlewka nr 1)

i wymieszać (wstrząsając zlewką),

-

odstawić na 3 min.

·

Ciecz znad osadu przesączyć do szklanego cylindra miarowego przez miękki

sączek bibułowy w celu zmierzenia objętości.

-

w innym szklanym cylindrze miarowym odmierzyć taką samą objętość 95

% etanolu.

·

Do plastikowego pojemnika (zlewki – przesącz z glikogenem) przelać przesącz

i dodawać, stale mieszając 95 % etanol.

·

Zamknąć zlewkę, wymieszać i oddać prowadzącemu.

Wytracony glikogen po odsączeniu będzie wykorzystany w kolejnych ćwiczeniach.


Zadanie 3. Izolacja kwasów nukleinowych z komórek bakterii.

Wykonanie:

· Do probówki Eppendorfa dodać:

- 0,1 ml gęstej zawiesiny bakterii (E. Coli)

- 0,4 ml r-ru lizującego: 3 % SDS w buforze TRIS 50 mM o pH 12,6

· „eppendorfkę” umieścić w łaźni wodnej o temp. 55

O

C na 10

¸ 20 minut,

· następnie dodać :

- 0,5 ml mieszaniny odbiałczającej: chloroform – fenol 1:1,

· odwirować próbę w temp. 4

O

C (wirówka Eppendorfa umieszczona w lodówce)

przy 6000 obrotów przez 5 minut.

· Wytrącone DNA nawinąć na bagietkę i przenieść do nowej probówki Eppendorfa.

Uzyskany materiał zostanie zamrożony i posłuży do dalszych badań (elektroforeza).

3

Zadanie 4. Otrzymywanie preparatu inwertazy z drożdży.

Wykonanie:

· 5 g drożdży rozcierać w moździerzu z piaskiem,

- przez 5 min dodać około 25 ml. wody i ponownie dokładnie rozetrzeć.

· Odwirować w temp. 20

0

C, przez 10 min. przy 6 000 obr/min., lub przesączyć.

· Zmierzyć za pomocą szklanego cylindra miarowego objętość supernatantu

(cieczy nadosadowej),

· Do innego szklanego cylindra miarowego odmierzyć 5-krotną objętość acetonu

- przelać do plastikowej zlewki nr 1.

· Supernatant też przelać do zlewki nr 1 (tej, w której jest już aceton).
· Zakręcić pojemnik i wymieszać. Wytrąca się osad.
· Próbę należy przesączyć na miękkim sączku bibułowym.
· Na sączku osadza się osad, który następnie należy zebrać za pomocą plastikowej

łyżeczki do plastikowego pojemnika (zlewki nr 2)

· Osad w zlewce nr 2 należy rozpuścić w 20 ml. wody destylowanej dodawanej

porcjami.

· Sączyć na miękkim sączku bibułowym do plastikowego pojemnika (zlewki -

inwertaza z drożdży).

Uzyskany przesącz zawierający enzym można przechowywać w lodówce przez kilka

tygodni. Inwertaza po 50-krotnym rozcieńczeniu będzie wykorzystywana w dalszych

ćwiczeniach do badań nad aktywnością enzymatyczną.