Æwiczenie 1

ZAKŁAD OPAKOWALNICTWA I BIOPOLIMERÓW

CHEMIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenia laboratoryjne nr 4

Badanie właściwości i analiza jakościowa tłuszczów

Artur Bartkowiak, Szczecin 2003

Ekstrakcja tluszczów w aparacie Soxhleta

(M. Struszyński 1954: Analiza ilościowa i techniczna, t.3. PWT, Warszawa, s. 547-550)

Ilościowa ekstrakcja tluszczów metodą Soxhleta sprowadza się do przemywania eterem tkanki

wysuszonej do stałej wagi i rozdrobnionej - aż do całkowitego wymycia substancji

rozpuszczalnych w eterze. Oznacza się masę suchej, badanej próbki oraz masę pozostałości

lipidowej po odparowaniu i wysuszeniu do stałej masy ekstraktu eterowego. Zawartość tłuszczu

wyraża się w procentach suchej masy badanego materiału. Jeżeli ekstrakcja ogranicza się tylko

do ilościowego oznaczenia zawartości tłuszczów (wyekstrahowany materiał tłuszczowy nie jest

poddawany frakcjonowaniu i dalszym analizom), wówczas ilość tłuszczów można wyznaczyć z

różnicy masy suchej próbki badanej przed ekstrakcją i masy suchej pozostałości tkanki

uzyskanej po ekstrakcji. Unika się wówczas odparowywania dużych ilości rozpuszczalnika i

suszenia do stałej wagi kolby z pozostałością lipidową.

Dokładność ilościowego oznaczenia zawartości tłuszczów w materiale biologicznym zależy od

stopnia rozdrobnienia tkanki, zawartości wody, szybkości ekstrakcji, warunków suszenia

pozostałości lipidowej itp. W przypadku materiału bogatego w tłuszcz osiągalna dokładność

metody wynosi około 0,5%.

Materiał: Nasiona roślin oleistych, materiał zwierzęcy bogaty w tłuszcz

Odczynniki:

1) Eter ety1owy.

2) Bibuła celulozowa

Aparatura: Aparat Soxhleta (3 zestawy).

Aparat Soxhleta składa się z kolby a o pojemności 100-300 cm

(a), ekstraktora (b) chłodnicy

wodnej (c). Wszystkie te części połączone są za pomocą znormalizowanych szlifów według

schematu podanego na rys. 1.

Gdy ogrzewa się w koszu grzewczym kolbę (a) zawierającą eter (Uwaga! materiał palny), pary

eteru przedostają się do chłodnicy wodnej, gdzie ulegają skropleniu. Skroplony eter spływa do

ekstraktora i wymywa tłuszcz z materiału umieszczonego w torebce z bibuły. Po napełnieniu

syfonu ekstraktora wyciąg eterowy przelewa się do kolby. W stale ogrzewanej kolbie ekstrakcja

przebiega w sposób ciągły przy czym - zależnie od szybkości parowania rozpuszczalnika w

kolbie i pojemności ekstraktora - przelewy następują co 5-30 min.

Rys. 1. Aparat Soxhleta: (a) – kolba, (b) – ekstraktor, (c) - chłodnica

Przygotowanie torebki z bibuły: Prostokąt bibuły o odpowiednich wymiarach (rys. 2) złożyć wzdłuż dłuższej osi na

połowę; po rozłożeniu wyciąć zakreskowane części i rozciąć dolną część na paski o szerokości 1,5-2 cm. Tak

przygotowaną bibułę nawinąć na walec o średnicy nieco mniejszej od średnicy ekstraktora. W miarę nawijania

każdy pasek zaginać tak, aby utworzyć dno torebki. Torebkę obwiązać nitką i ostrożnie zdjąć z walca.

Rys. 2. Torebka z bibuły: a – podwójna wysokość w aparacie Soxhleta, b – 2,5-krotny wymiar a

Wykonanie:

Do kolby (a) wrzucić porcelankę i starannie wysuszoną całość zważyć z dokładnością do 1 mg.

Kolbę połączyć z ekstraktorem i umieścić w łaźni wodnej. Następnie 2-5 g tkanki wysuszonej

do stałej wagi i roztartej starannie w moździerzu odważyć z dokładnością do 0,01% i przenieść

ilościowo do torebki. Torebkę umieścić w ekstraktorze tak, aby górna jej część znajdowała się

poniżej najwyższego punktu rurki przelewowej.

Ekstraktor napełnić eterem do zagięcia rurki syfonu i po spłynięciu rozpuszczalnika do kolby

dodać jeszcze około 0,5 objętości eteru (ilość eteru dodanego nie może przekraczać objętości

pustego ekstraktora). Ekstraktor połączyć z chłodnicą wodną i włączyć ogrzewanie kolby z

eterem (autotransformator w poz. 100). Następuje ciągłe napełnianie ekstraktora skroplonym

eterem i przelewanie eteru do kolby, w wyniku czego tłuszcze zostają wyekstrahowane z tkanki.

Czas potrzebny na całkowite odtłuszczenie wynosi dla większości tkanek 2-4 godz.

Koniec ekstrakcji można ustalić za pomocą próby odparowania eteru. W tym celu po

wyłączeniu ogrzewania i ustaniu wrzenia należy zdjąć chłodnicę i nieco eteru z ekstraktora

przenieść na czyste, odtłuszczone szkiełko zegarkowe. Proces ekstrakcji jest zakończony

wówczas, gdy po wyparowaniu eteru ze szkiełka nie pozostają na nim ślady tłuszczu.

Po skończonej ekstrakcji (w ćwiczeniu po 2 godz. Ekstrakcji – 3-4 pełne przelewy) przelać eter

z ekstraktora (przez boczną rurkę) do kolby, wyjąć torebkę, a ekstraktor ponownie połączyć z

kolbą i chłodnicą i oddestylować całą zawartość eteru z kolby do ekstraktora (opróżniać

ekstraktor gdy poziom ekstraktu za każdym razem przekroczy ¾ wysokości syfonu). Kolbę z

ekstraktem tłuszczowym wysuszyć w gorącej łaźni wodnej w ciągu 5 min i pozostawić do

następnego ćwiczenia w kolbie zamkniętej korkiem szklanym.

Następnie w ciągu 30 min w temp. 90°C suszyć w suszarce, do stałej wagi. Po wystudzeniu

zważyć kolbę z dokładnością do 1 mg. Zawartość tłuszczu wyrazić w procentach suchej masy

materiału odtłuszczanego.

% zawartość tłuszczu = 100

⋅(a -b)/c,

gdzie: a -masa kolby wraz z pozostałością lipidową w gramach, b -masa samej kolby w

gramach, c -ilość gramów odtłuszczanego materiału.

Podstawowe właściwości fizykochemiczne lipidów

Lipidy oraz związki pokrewne (steroidy i karotenoidy) są nierozpuszczalne w wodzie.

Rozpuszczają się natomiast dobrze w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak

benzen, chloroform, aceton, toluen i eter, a w mniejszym stopniu także w etanolu i metanolu. W

lipidach rozpuszczają się związki o właściwościach hydrofobowych, tj. związki, które nie mają

grup hydrofilowych lub zawierają ich niewiele.

Ćwiczenie 1. Rozpuszczalność barwników i witamin w tłuszczach

a) Do 2 cm

wody destylowanej dodać nieco barwnika Sudan III. Obserwować czy barwnik

rozpuszcza się. Wprowadzić następnie 0,5 cm

oleju i zmieszać zawartość probówki.

Obserwować zachodzące zmiany rozpuszczalności.

Barwnik o dużej masie cząsteczkowej Sudan III, stosowany do wybarwiania tłuszczu w

preparatach histologicznych, zawiera tylko jedną grupę hydrofilową i długi, niepolarny łańcuch

węglowodorowy - dzięki temu jest dobrze rozpuszczalny w tłuszczach. Tłuszcze są również

dobrym rozpuszczalnikiem dla witamin z grupy A, D, E i K. Witamina A, wywodząca się z

karotenoidów, zawarta jest w tranie. W maśle i tranie występuje duża ilość witaminy z grupy D.

W olejach roślinnych znajdują się tokoferole, witaminy z grupy E. W tłuszczach roślinnych, a w

mniejszym stopniu także w tłuszczach zwierzęcych, występują karotenoidy nadające im

żółtoczerwone zabarwienie. Tłuszczom naturalnym często towarzyszą związki steroidowe,

zwłaszcza cholesterol, tworzący estrowe połączenia z kwasami tłuszczowymi.

Ćwiczenie 3. Wykrywanie steroidów. Próba Liebermanna i Burcharda.

Do 2 kropli tłuszczu (0,4 g) (olej roślinny, smalec, masło) rozpuszczonych w 1 cm

chloroformu

w suchych probówkach dodać 0,5 cm

bezwodnika kwasu octowego i ostrożnie po ściankach

probówek 2 krople stężonego roztworu H

. Tworzące się produkty reakcji o barwie różowej

przechodzącej przez fioletową i niebieską w zieloną świadczą o obecności tej grupy produktów.

W warunkach bezwodnych stężony roztwór H

i bezwodnik kwasu octowego odwadniają

cząsteczkę cholesterolu, co prowadzi do powstania dodatkowego podwójnego wiązania,

sprzężonego z wiązaniem podwójnym obecnym w cząsteczce cholesterolu. Związki zawierające

podwójne wiązania sprzężone są barwne i wybiórczo pochłaniają promienie świetlne o

określonej długości fali. W próbie Salkowskiego, W obecności stężonego roztworu H

powstaje czerwony kwas disulfonowy dicholestadienu, natomiast w próbie Liebermanna i

Burcharda (H

i bezwodnik kwasu octowego) - zielono zabarwiony kwas jedno- sulfonowy

dicholestadienu.

Mydła.

Tłuszcze pod wpływem przegrzanej pary wodnej ulegają hydrolizie, dając glicerol i wolne

kwasy tłuszczowe. Rozkład ten można również osiągnąć za pomocą hydrolizy zasadowej (KOH

lub NaOH), z tym że otrzymuje się wówczas odpowiednie sole kwasów tłuszczowych nazywane

mydłami, a sam proces nosi miano zmydlenia tłuszczu. Sole sodowe i potasowe kwasów

tłuszczowych dobrze rozpuszczają się w wodzie, tworząc micelarne roztwory koloidowe. Sole

metali dwuwartościowych (Ba

, Ca

, Pb

) są natomiast nierozpuszczalne (mydła

nierozpuszczalne).

Mydła tworzą koloidy hydrofilowe lub hydrofobowe w zależności od środowiska. W roztworze

wodnym grupy polarne (-COONa) skierowane są na zewnątrz, a podstawniki hydrofobowe

(węglowodorowe) do wnętrza micelarnych kuleczek mydła. W rozpuszczalnikach organicznych

układ tych grup jest odwrotny (micela odwrócona). Grupy hydrofilowe i hydrofobowe mydła

ustawiają się zatem w charakterystyczny sposób na granicy faz i zmniejszają napięcie

powierzchniowe. Związki zmniejszające napięcie powierzchniowe są dobrymi emulgatorami.

Poza mydłami należą do nich detergenty i kwasy żółciowe. W ich obecności powstaje trwała

emulsja tłuszczu z wodą.

Ćwiczenie 4. Zmydlenie tłuszczów

W parownicy porcelanowej ogrzać około 5 g smalcu. Dodać następnie 8 cm

30% roztworu

NaOH, potem 5 cm

etanolu i mieszać, ogrzewając łagodnie przez kilka minut, aż do utworzenia

się jednolitej masy (mydła). Do otrzymanego mydła przeniesionego do kolby okrągłodennej

wprowadzić ok. 200 cm

wrzącej wody i ogrzewać aż do całkowitego rozpuszczenia się mydła.

a) Otrzymywanie mydła nierozpuszczalnego. Do 2 probówek zawierających po 2 cm

roztworu

mydła dodać po 0,5 cm

% roztworów CaCl

i/lub BaCl

. Wytrąca się osad nierozpuszczalnych

mydeł wapniowych i/lub barowych.

b) Tworzenie trwałej emulsji tłuszczu w obecności mydła. Do 2 probówek zawierających po 0,5

oleju wprowadzić po 4 cm

wody lub mydła. Zawartość probówek silnie wstrząsnąć.

Zaobserwować i opisać rodzaj tworzących się układów.

Ćwiczenie 5. Liczba jodowa (LJ)

(M. Struszynski 1954: Analiza ilościowa i techniczna, t. 3. PWT, Warszawa, s. 478-480)

Zasada: LJ oznacza tę ilość gramów jodu, która zostaje przyłączona do 100 g tłuszczu. Liczba ta

wyraża ilościowo zawartość nienasyconych związków w tłuszczu.

Tłuszcze o dużej zawartości estrów nienasyconych kwasów tłuszczowych, np. oleje roślinne,

charakteryzują się dużą liczbą jodową (olej rzepakowy). Tłuszcze stałe o małej zawartości

nienasyconych wiązań mają natomiast małą liczbę jodową (np. masło, smalec).

Tłuszcz rozpuszczony w obojętnym rozpuszczalniku organicznym traktuje się nadmiarem

mianowanego roztworu chlorowca w takich warunkach, aby nastąpiło tylko jego przyłączenie, a

nie podstawienie. Następnie dodaje się roztwór jodku potasu. Nadmiar chlorowca ruguje jod,

który odmiareczkowuje się roztworem Na

. Z różnicy między ilością jodu uwolnionego w

próbie kontrolnej i badanej otrzymuje się tą ilość jodu, która została przyłączona przez daną

ilość badanego tłuszczu. Do ilościowego przyłączenia chlorowców nadają się ICl i IBr. Chociaż

reakcja przyłączenia czystego chloru zachodzi najenergiczniej, to jednak chlor podstawia

częściowo wodór. Czysty brom i jod reagują natomiast zbyt wolno i dlatego się ich nie

stosuje.

Materiał: Masło, olej.

Odczynniki:

1) Odczynnik Hanusa: 10 g IBr rozpuścić w 500 cm

COOH lodowatego

2) 10% roztwór KI.

3) 0,1 M roztwór Na

4) 1% roztwór skrobi

5) Chloroform

Wykonanie: W naczyńku wagowym odważyć dokładnie 0,2 g oleju lub 0,4 g masła/smalcu.

Naczyńko wprowadzić ostrożnie do kolby stożkowej o pojemności 200-300 cm

doszlifowanym korkiem, zwilżonym uprzednio roztworem KI. Następnie dodać 10 cm

chloroformu i starannie rozpuścić odważkę tłuszczu. Dodać 15 cm

odczynnika Hanusa, kolbę

starannie zamknąć korkiem i po wymieszaniu pozostawić w ciemnym miejscu na 30 min.

Równolegle wykonać próbę kontrolną nie zawierającą tłuszczu. Po upływie tego czasu

wprowadzić 15 cm

10% roztworu KI (zmywając nim szyjkę kolby i korek) oraz ok. 50 cm

wody. W wyniku reakcji IBr i KI uwalnia się I

IBr + KI

→ I

+ KBr

Jod odmiareczkować za pomocą 0,1 M roztworu Na

(do słabo różowego zabarwienia),

dodać wskaźnika skrobiowego i skończyć miareczkowanie.

LJ = 1,269

⋅(a - b)/c,

gdzie: a -liczba cm

0,1 M roztworu Na

potrzebna do zmiareczkowania próby kontrolnej,

b -liczba cm

0,1 M roztworu Na

potrzebna do zmiareczkowania badanej próby, c -masa

tłuszczu w gramach.

Ćwiczenie 6. Liczba zmydlenia (LZ)

Zasada: LZ jest to liczba miligramów KOH potrzebna do zmydlenia 1 g i zobojętnienia

zawartych w nim wolnych kwas6w tłuszczowych. Znajomość liczby zmydlenia pozwala

wyznaczyć średnią masę cząsteczkową kwasów tłuszczowych wchodzących w skład danego

tłuszczu.

Tłuszcze zawierające stosunkowo dużą ilość estrów kwasów o mniejszej masie cząsteczkowej,

jak: masłowy, kaprylowy (masło, olej kokosowy) mają dużą liczbę zmydlenia. Natomiast

tłuszcze o dużym odsetku estrów długołańcuchowych kwasów tłuszczowych (olej rzepakowy,

słonecznikowy), mają małe liczby zmydlenia. Obecność substancji nie ulegających zmydleniu,

np. olejów mineralnych, zmniejsza liczbę zmydlenia. Domieszka takich substancji w ilości 1%

zmniejsza LZ o 1,7-2,5 jednostek.

Materiał: Masło, smalec, olej.

Odczynniki:

1) 0,5 M roztwór KOH

2) 96% roztwór etanolu

3) 0,5 M roztwór HCI

4) 1% etanolowy roztwór fenoloftaleiny.

Wykonanie: Do kolby stożkowej o pojemności 200- 300 cm

odważyć w naczyńku wagowym

ok. 1 g tłuszczu (2 powtórzenia dla każdego rodzaju tłuszczu), dodać 10 cm

0,5 M roztworu

KOH i 50 cm

etanolu. Zawartość kolby ogrzewać pod chłodnicą zwrotną w ciągu 20 min we

wrzącej łaźni wodnej. W wyniku hydrolizy tłuszcz zostaje rozłożony do glicerolu i kwasów

tłuszczowych, które z wodorotlenkiem potasu dają mydła. Nadmiar KOH odmiareczkować 0,5

M roztworem HCl wobec fenoloftaleiny. Równolegle należy wykonać próbę kontrolną, nie

zawierającą tłuszczu.

LZ = 28,055

⋅(a - b)/c,

gdzie: a -liczba cm

0,5 M roztworu HCl potrzebna do zmiareczkowania próby kontrolnej, b -

liczba cm

0,5 M roztworu HCl potrzebna do zmiareczkowania próby badanej, c -ilość gramów

tłuszczu.

IMIĘ I NAZWISKO GRUPA DATA

SPRAWOZDANIE Z ĆWICZENIA NR 4

Badanie właściwości i analiza jakościowa tłuszczów

Ćwiczenie 1. Rozpuszczalność barwników i witamin w tłuszczach

Barwnik Sudan III rozpuszcza się w…………………………..
Posiada właściwości………………………………….., ponieważ……………………………

Ćwiczenie 2. Wykrywanie steroidów. Próba Liebermanna i Burcharda.

1. W których probówkach znajdowały się następujące substancje: olej roślinny, smalec,

masło?

2. Czy na podstawie zmiany intensywności barwy można określić ilościowo zawartość

cholesterolu w badanych próbkach, (jeżeli tak to, w której próbce jest go najwięcej)?

3. Otrzymane wyniki skomentować/porównać z zawartością teoretyczną (Z.Sikorski,

Chemia Żywności, WNT 2000 lub inne poz. literaturowe).

Ćwiczenie 3. Mydła.

1. Co to są mydła?

IMIĘ I NAZWISKO GRUPA DATA

Ćwiczenie 4. Zmydlenie tłuszczów

1. Co decyduje o właściwościach emulgujących soli kw. tłuszczowych?

2. W jakich gałęziach przemysłu spożywczego, (do jakich wyrobów) i jakie inne

emulgatory są stosowane na bazie modyfikowanych tłuszczów (samodzielna praca w

bibliotece)?

Ćwiczenie 5. Liczba jodowa (LJ)

Wynik liczby jodowej substancji a) LJ=
substancji b) LJ=

Gdzie znajdowało się masło a gdzie olej roślinny, która to substancja?

Suma punktów ………