Ćwiczenie
T: Metody oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów
1) Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów w 1 ml (NPL)
a) metoda probówkowa
b) metoda płytek agarowych
2) Oznaczanie liczby bakterii w 100 ml próby badanej
3) Metoda filtrów membranowych
1) Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów w 1 ml (NPL)
a) metoda probówkowa
wykonujemy 6 rozcieoczeo badanej próby w postępie dziesiętnym; rozcieoczenia
wykonujemy w 0,85% NaCl [1ml do 9ml, 1 ml do 9ml, 1ml do 9ml itd.)
każdemu rozcieoczeniu próby przyporządkowujemy 5 probówek wypełnionych 10 ml
bulionu zwykłego. Do każdej z tych 5 probówek wlewamy po 1 ml próby z odpowiedniego
rozcieoczenia.
inkubujemy 24 h
zliczamy probówki z poszczególnych rozcieoczeo w których obserwujemy wzrost bakterii
(wynik dla każdego z rozcieoczeo będzie od zera do pięciu)
zapisujemy wyniki i układamy tzw. liczbę charakterystyczną; liczba charakterystyczna
składa się z 3 cyfr;
pierwsza cyfra przyporządkowana jest ostatniemu rozcieoczeniu, które daje wzrost we
wszystkich próbach (lub w maksymalnej ilości prób jeżeli w żadnej nie ma 5), a kolejne
cyfry liczby charakterystycznej oznaczają liczbę prób dodatnich z kolejnych rozcieoczeo
Przykład
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
5
5
5
2
0
0
Odczytana liczba charakterystyczna to 520
Porównujemy wynik z tablicami Makrediego:
Wynik dla 520 odczytany z tablic to 5
Określamy Najbardziej Prawdopodobną Liczbę Bakterii w 1 ml:
NPL=5 x odwrotnośd rozcieoczenia pierwszej cyfry liczby charakterystycznej
NPL=5x10
3
=5000
Wyjątki:
jeżeli we wszystkich próbach obserwujemy wzrost to bierzemy 3 ostatnie cyfry,
odczytujemy z tablic McCrady’ego ale przy określaniu NPL stawiamy znak większości, a nie
równości
5
5
5
5
5
5
jeżeli 2
0
0
0
0
0
to 200 x 10
1
jeżeli 5
5
3
1
1
0
to dodajemy ostatnie 2 cyfry czyli
nasza liczba charakterystyczna to 532
b) metoda płytek agarowych (metoda płytek lanych)
wykonujemy rozcieoczenia dziesiętne badanej próby
każdemu rozcieoczeniu przyporządkowujemy 2 płytki Petriego
na każdą płytkę wylewamy po 1 ml każdego rozcieoczenia i zalewamy 10 ml upłynnionego
agaru o temperaturze max. 42°C
inkubujemy 24 h
zliczamy liczbę kolonii (kolonie na powierzchni i kolonie wgłębne) w każdej parze płytek
agarowych
do obliczenia wyniku bierzemy pod uwagę płytki zawierające 10-300 kolonii; z każdej pary
płytek spełniających wymaganie wyciągamy średnią
Przykład:
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
>300 >300 70
9
0
1
>300 270
50
13
2
1
wynik to średnia z 70 i 50 czyli 60
mnożymy wynik przez odwrotnośd rozcieoczenia i otrzymujemy NPL jednostek
tworzących kolonie (CFU) w 1 ml
jeżeli będą 2 rozcieoczenia spełniające wymagania to oba bierzemy pod uwagę wyciągając
średnią
2) Oznaczanie liczby bakterii w 100 ml próby badanej
a) metoda posiewów trójkowych
wlewamy 3 x 10 ml badanej próby do trzech kolbek zawierających po 100 ml podłoża
wlewamy 3 x 1 ml badanej próby do trzech probówek zawierających po 10 ml podłoża
wlewamy 3 x 0,1 ml badanej próby do trzech probówek zawierających po 10 ml podłoża
Łącznie daje to 9 kolbek/probówek
inkubujemy 24h w optymalnej temperaturze
Zliczamy liczbę prób dodatnich w każdym rozcieoczeniu, np.:
3 x 10:100
3 x 10:10
3 x 0,1:10
1
0
1
Odczytujemy z tablic wartośd odpowiadającą ustalonym próbom (101). Wartośd
odczytana z tablic to NPL bakterii w 100 ml wody (wskaźnik wody).
Inny system posiewu:
3 x 100:100
3 x 10:10
3 x 1:10
W tym wypadku wynik odczytany z tablicy dzielimy przez 10 ponieważ podaliśmy 10x
więcej próby.
3) Metoda filtrów membranowych
przefiltrowad X ml próby przez krążek o odpowiedniej średnicy porów (może byd 1, 10, 50,
100 ml i inne objętości próby ale zawsze musimy przefiltrowad co najmniej 25 ml płynu;
jeżeli filtrujemy np. 1ml próby to dodajemy 24 ml 0,85% NaCl, żeby otrzymad 25 ml płynu)
krążek zdjąd z urządzenia filtrującego i umieścid na pożywce
inkubacja 24h w optymalnej temperaturze
zliczamy kolonie, które rosną na filtrze; bierzemy pod uwagę tylko liczbę kolonii
mieszczącą się w szeregu optymalnym tzn. 6-96 kolonii. Jeżeli liczba kolonii wykracza poza
szereg optymalny badanie należy powtórzyd wybierając inną objętośd filtrowanej próby.
obliczamy wskaźnik
Wskaźnik: liczba kolonii x 100 / ilośd przefiltrowanej wody w ml
obliczamy Miano
MIANO: najmniejsza objętośd próby, w której znajduje sie 1 komórka bakteryjna
MIANO=100/wskaźnik