Techniki biologii

Techniki biologii

molekularnej

molekularnej

Rozwój metod analizy

Rozwój metod analizy

kwasów nukleinowych:

kwasów nukleinowych:

•

Diagnostyka chorób dziedzicznych

Diagnostyka chorób dziedzicznych

•

Diagnostyka chorób infekcyjnych

Diagnostyka chorób infekcyjnych

•

Określanie zgodności genetycznej

Określanie zgodności genetycznej

tkanek

tkanek

•

Określanie pokrewieństwa

Określanie pokrewieństwa

•

Badanie śladów biologicznych

Badanie śladów biologicznych

Metody molekularne

Metody molekularne

•

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

•

Analiza całych cząsteczek DNA

Analiza całych cząsteczek DNA

•

Amplifikacja kwasów nukleinowych

Amplifikacja kwasów nukleinowych

(PCR)

(PCR)

•

RFLP (

RFLP (

Restriction Fragments Length

Restriction Fragments Length

Polymorphism)

Polymorphism)

•

Sekwencjonowanie

Sekwencjonowanie

Elektroforeza

Elektroforeza

•

Elektroforezę

Elektroforezę

przeprowadza się w celu

przeprowadza się w celu

wizualizacji DNA

wizualizacji DNA

•

Żele agarozowe lub

Żele agarozowe lub

poliakrylamidowe

poliakrylamidowe

•

Stosowane do rozdziału

Stosowane do rozdziału

oraz określenia wielkości

oraz określenia wielkości

cząsteczek DNA

cząsteczek DNA

•

Wykorzystanie

Wykorzystanie

ruchliwości cząsteczek

ruchliwości cząsteczek

DNA w polu elektrycznym

DNA w polu elektrycznym

Southern blotting

Southern blotting

Hybrydyzacja DNA

Hybrydyzacja DNA

Nothern blotting

Nothern blotting

Hybrydyzacja RNA

Hybrydyzacja RNA

Western blotting

Western blotting

Hybrydyzacja białka

Hybrydyzacja białka

Hybrydyzacja kwasów

Hybrydyzacja kwasów

nukleinowych

nukleinowych

•

Elektroforeza

Elektroforeza

•

Utrwalenie badanej próby

Utrwalenie badanej próby

na podłożu (membrana)

na podłożu (membrana)

•

Zablokowanie

Zablokowanie

niezwiązanych miejsc

niezwiązanych miejsc

•

Inkubacja z sondą

Inkubacja z sondą

•

Odpłukanie

Odpłukanie

niezwiązanych

niezwiązanych

cząsteczek

cząsteczek

•

Wywołanie -

Wywołanie -

uwidocznienie miejsc

uwidocznienie miejsc

powiązania sondy

powiązania sondy

z badaną próbą

z badaną próbą

Western

Western

blotting

blotting

Analiza całych cząsteczek

Analiza całych cząsteczek

DNA:

DNA:

Polimorfizm Konformacji

Polimorfizm Konformacji

Jednoniciowej (SSCP)

Jednoniciowej (SSCP)

•

W przypadku braku specyficznej

W przypadku braku specyficznej

sekwencji porównuje się całe

sekwencji porównuje się całe

cząsteczki DNA

cząsteczki DNA

•

Zmiana właściwości fizyko-

Zmiana właściwości fizyko-

chemicznych DNA

chemicznych DNA

spowodowana różnicami składu

spowodowana różnicami składu

nukleotydowego

nukleotydowego

•

Wykorzystanie różnic

Wykorzystanie różnic

mobilności cząsteczek w żelu

mobilności cząsteczek w żelu

•

Nawet pojedyncza mutacja

Nawet pojedyncza mutacja

może powodować zmiany

może powodować zmiany

konformacji, co skutkuje zmianą

konformacji, co skutkuje zmianą

mobilności DNA

mobilności DNA

Single-strand conformational
polymorphism (SSCP) – wykrywanie
pojedynczych mutacji

PCR (Polymerase Chain

PCR (Polymerase Chain

Reaction)

Reaction)

Naśladuje zachodzącą

Naśladuje zachodzącą

in vivo

in vivo

replikację DNA

replikację DNA

i wymaga następujących składników

i wymaga następujących składników

reakcji:

reakcji:

•

matrycy DNA

matrycy DNA

•

starterów komplementarnych do końców

starterów komplementarnych do końców

wybranej sekwencji DNA

wybranej sekwencji DNA

•

czterech trójfosforanów

czterech trójfosforanów

deoksynukleotydów (dNTP)

deoksynukleotydów (dNTP)

•

termostabilnej polimerazy DNA

termostabilnej polimerazy DNA

•

jonów Mg

jonów Mg

2+

2+

Cykl reakcji PCR obejmuje

Cykl reakcji PCR obejmuje

następujące po sobie 3 etapy:

następujące po sobie 3 etapy:

•

denaturacja dupleksu DNA

denaturacja dupleksu DNA

w temp. 92

w temp. 92

o

o

C – 96

C – 96

o

o

C

C

•

hybrydyzacja starterów do

hybrydyzacja starterów do

komplementarnych miejsc na

komplementarnych miejsc na

matrycy w temp. 37

matrycy w temp. 37

o

o

C – 72

C – 72

o

o

C

C

•

wydłużanie startera przez

wydłużanie startera przez

dosyntetyzowanie kolejnych

dosyntetyzowanie kolejnych

deoksynukleotyów przy

deoksynukleotyów przy

udziale polimerazy DNA w

udziale polimerazy DNA w

temperaturze 72

temperaturze 72

o

o

C

C

Powtarzanie takich cykli daje

Powtarzanie takich cykli daje

w efekcie powielenie

w efekcie powielenie

zdefiniowanej sekwencji DNA

zdefiniowanej sekwencji DNA

Schemat cyklu w reakcji
PCR

W wyniku PCR liczba
cząsteczek DNA rośnie
w postępie
geometrycznym (po
każdym cyklu ich liczba
ulega podwojeniu). Po
zakończeniu około 30
cykli liczba kopii DNA
przekracza

kilka

milionów

.

2

n

gdzie n jest liczbą cykli

PCR przeprowadza się w bloku grzejnym
zwanym termocyklerem, gdzie ustawia się
czas i temperaturę poszczególnych cykli.

Wśród prób do reakcji PCR przygotowuje się
także kontrolę dodatnią i ujemną w celu
sprawdzenia prawidłowości przebiegającej
reakcji.

Modyfikacje metody PCR

Modyfikacje metody PCR

•

Nested PCR (wewnętrzny)

Nested PCR (wewnętrzny)

•

RT-PCR

RT-PCR

•

PCR-RFLP (polimorfizm długości

PCR-RFLP (polimorfizm długości

fragmentów restrykcyjnych)

fragmentów restrykcyjnych)

•

Real-time PCR (w czasie rzeczywistym)

Real-time PCR (w czasie rzeczywistym)

•

Multiplex PCR

Multiplex PCR

•

Qantititative PCR (ilościowy)

Qantititative PCR (ilościowy)

•

Competitive PCR (konkurujący)

Competitive PCR (konkurujący)

•

Touch-down PCR (hamowany)

Touch-down PCR (hamowany)

•

RAPD-PCR (losowa amplifikacja

RAPD-PCR (losowa amplifikacja

polimorficznego DNA)

polimorficznego DNA)

•

Booster PCR (regulowany)

Booster PCR (regulowany)

•

Race PCR

Race PCR

RT-PCR

RT-PCR

reverse transcriptase polymerase chain

reverse transcriptase polymerase chain

reaction

reaction

- badanie ekspresji genów

- badanie ekspresji genów

RNA

odwrotna

transkryptaza

cDNA

polimeraza DNA (PCR)

kopie DNA

Nested-PCR (wewnętrzny)

Nested-PCR (wewnętrzny)

•

Dwie pary starterów:

Dwie pary starterów:



Pierwsza

para

Pierwsza

para

zewnętrzna

zewnętrzna



Druga

para

Druga

para

wewnętrzna

wewnętrzna

•

Amplifikacja DNA jest

Amplifikacja DNA jest

dwuetapowa

dwuetapowa

•

Dzięki użyciu dwóch

Dzięki użyciu dwóch

par

starterów

par

starterów

zwiększona

zwiększona

specyficzność

i

specyficzność

i

czułość metody

czułość metody

Zastosowanie techniki PCR

Zastosowanie techniki PCR

DIAGNOSTYKA MIKROORGANIZMÓW (JAKOŚCIOWA I

ILOŚCIOWA):

zakażenia bakterią: Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae,

Mycobacterium tuberculosis, Borrelia burgdorferii

zakażenia pierwotniakiem Toxoplasma gondii

zakażenia wirusem HIV, CMV (cytomegalia), Herpes simplex

(opryszczka narządów płciowych), zapalenia wątroby typu B (HBV) i

typu C (HCV)

DIAGNOSTYKA CHORÓB NOWOTWOROWYCH:

diagnostyka mutacji w genach BRCA1 i BRCA2

diagnostyka ryzyka nowotworowego - mutacje genów kodujących

białka naprawcze, odpowiedzialne za nadwrażliwość na estrogeny

diagnostyka zagrożenia nowotworem szyjki macicy – wykrywanie

wirusa HPV (wiru brodawczaka ludzkiego)

DIAGNOSTYKA CHORÓB GENETYCZNYCH



mukowiscydoza



dystrofia mięśniowa (Duchennea i Beckera)



choroba Alzheimera (genotypowanie ApoE)



dziedziczna skłonność miażdżycowa



Choroba Parkinsona



CCR5 (mutacja odpowiedzialna za odporność na HIV)

DIAGNOSTYKA NIEPŁODNOŚCI MĘSKIEJ O PODŁOŻU GENETYCZNYM



(polegającej na braku plemników w nasieniu - mikrodelecje na chromosomie Y)

USTALANIE POKREWIEŃSTWA I OJCOSTWA

KRYMINALISTYKA

BADANIE ŻYWNOŚCI W KIERUNKU MODYFIKACJI GENETYCZNEJ GMO



(kukurzydza, soja, zboża, pomidory, ziemniaki, buraki cukrowe etc.) - analiza

jakościowa

i ilościowa

BADANIA MIKROBIOLOGICZNE ŻYWNOŚCI



(Staphylococcus aureus, Salmonella species, Shigella species, Listeria species)

BADANIA NAUKOWE



(biologia molekularna, biotechnologia, badania ewolucyjne, antropologia,

badania środowiskowe)

Mikrodelecje w obrębie chromosomu Y

PGD

Diagnostyka

preimplanatcyj

na

Pozwala na
genetyczną
analizę komórek
jajowych przed
zapłodnieniem
bądź też
zarodków przed
implantacją
metodą
wspomaganego
rozrodu.

Enzymy restrykcyjne

Enzymy restrykcyjne

•

Enzymy uzyskane z bakterii,

Enzymy uzyskane z bakterii,

chronią je przed obcymi

chronią je przed obcymi

cząsteczkami DNA

cząsteczkami DNA

•

Rozpoznają i przecinają 4, 6

Rozpoznają i przecinają 4, 6

rzadziej 8 nukleotydowe

rzadziej 8 nukleotydowe

sekwencje

sekwencje

•

Zamiana, delecja lub insercja

Zamiana, delecja lub insercja

jednej lub kilku par zasad może

jednej lub kilku par zasad może

spowodować brak lub nowe

spowodować brak lub nowe

miejsce cięcia dla enzymów

miejsce cięcia dla enzymów

Schemat cięcia enzymem
EcoR1

RFLP

RFLP

(Restriction Fragments

(Restriction Fragments

Length Polymorphism )

Length Polymorphism )

•

Polimorfizm długości fragmentów

Polimorfizm długości fragmentów

restrykcyjnych

restrykcyjnych

•

Różnicowanie organizmów

Różnicowanie organizmów

•

Badanie pokrewieństwa

Badanie pokrewieństwa

•

Różnica długości fragmentów DNA

Różnica długości fragmentów DNA

pociętych enzymami

pociętych enzymami

restrykcyjnymi

restrykcyjnymi

1.AT

1.AT

CGAG

CGAG

TTACCCGGGACCT

TTACCCGGGACCT

CGAG

CGAG

TTTATATAC

TTTATATAC

2.AT

2.AT

CGAG

CGAG

TTACCCGGGACCTCG

TTACCCGGGACCTCG

G

G

GTTTATATAC

GTTTATATAC

3.AT

3.AT

CGAG

CGAG

TTACC

TTACC

CG

CG

A

A

G

G

ACCT

ACCT

CGAG

CGAG

TTTATATAC

TTTATATAC

4.AT

4.AT

CGAG

CGAG

TTACC

TTACC

T

T

GGGACCT

GGGACCT

CGAG

CGAG

TTTATATAC

TTTATATAC

Schemat elektroforezy

Schemat elektroforezy

PCR – RFLP

PCR – RFLP

mukowiscydoza

mukowiscydoza

Fingerprint

Fingerprint

•

VNTR (

VNTR (

Variable Number of Tandem

Variable Number of Tandem

Repeats

Repeats

) zmienna liczba

) zmienna liczba

tandemowych powtórzeń

tandemowych powtórzeń

•

Zmienność sekwencji

Zmienność sekwencji

mikrosatelitarnych polega na różnej

mikrosatelitarnych polega na różnej

liczbie powtórzeń danego motywu w

liczbie powtórzeń danego motywu w

określonym locus

określonym locus

Użycie sekwencji VNTR
w medycynie sądowej

DNA fingerprinting - odcisk palca

DNA fingerprinting - odcisk palca

genomowego

genomowego

Sekwencjonowanie

Sekwencjonowanie

Metoda wykorzystywana do :

Metoda wykorzystywana do :

•

wykrywania nowych mutacji

wykrywania nowych mutacji

•

diagnostyki gatunków

diagnostyki gatunków

niedostatecznie poznanych, nowych

niedostatecznie poznanych, nowych

szczepów

szczepów

Metoda Maxama - Gilberta

Metoda Maxama - Gilberta

Metoda chemicznego zrywania wiązań,
aktualnie wyparta przez metodę
Sangera. Seria czterech reakcji
chemicznych w wyniku których DNA
przecinane jest w miejscu wystąpienia
G, A, T lub C.

Metoda

Metoda

Sangera

Sangera

Powszechnie stosowana metoda
do sekwencjonowania.

Wydłużanie łańcucha DNA
w czterech mieszaninach, z
których każda zawiera inny
ddNTP.
W każdej reakcji powstaje seria
fragmentów DNA o różnych
długościach zakończonych na
jednej z zasad.