Techniki biologii
Techniki biologii
molekularnej
molekularnej
Techniki biologii
Techniki biologii
molekularnej
molekularnej
Rozwój metod analizy
Rozwój metod analizy
kwasów nukleinowych:
kwasów nukleinowych:
•
Diagnostyka chorób dziedzicznych
Diagnostyka chorób dziedzicznych
•
Diagnostyka chorób infekcyjnych
Diagnostyka chorób infekcyjnych
•
Określanie zgodności genetycznej
Określanie zgodności genetycznej
tkanek
tkanek
•
Określanie pokrewieństwa
Określanie pokrewieństwa
•
Badanie śladów biologicznych
Badanie śladów biologicznych
Metody molekularne
Metody molekularne
•
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
•
Analiza całych cząsteczek DNA
Analiza całych cząsteczek DNA
•
Amplifikacja kwasów nukleinowych
Amplifikacja kwasów nukleinowych
(PCR)
(PCR)
•
RFLP (
RFLP (
Restriction Fragments Length
Restriction Fragments Length
Polymorphism)
Polymorphism)
•
Sekwencjonowanie
Sekwencjonowanie
Elektroforeza
Elektroforeza
•
Elektroforezę
Elektroforezę
przeprowadza się w celu
przeprowadza się w celu
wizualizacji DNA
wizualizacji DNA
•
Żele agarozowe lub
Żele agarozowe lub
poliakrylamidowe
poliakrylamidowe
•
Stosowane do rozdziału
Stosowane do rozdziału
oraz określenia wielkości
oraz określenia wielkości
cząsteczek DNA
cząsteczek DNA
•
Wykorzystanie
Wykorzystanie
ruchliwości cząsteczek
ruchliwości cząsteczek
DNA w polu elektrycznym
DNA w polu elektrycznym
Southern blotting
Southern blotting
Hybrydyzacja DNA
Hybrydyzacja DNA
Nothern blotting
Nothern blotting
Hybrydyzacja RNA
Hybrydyzacja RNA
Western blotting
Western blotting
Hybrydyzacja białka
Hybrydyzacja białka
Hybrydyzacja kwasów
Hybrydyzacja kwasów
nukleinowych
nukleinowych
•
Elektroforeza
Elektroforeza
•
Utrwalenie badanej próby
Utrwalenie badanej próby
na podłożu (membrana)
na podłożu (membrana)
•
Zablokowanie
Zablokowanie
niezwiązanych miejsc
niezwiązanych miejsc
•
Inkubacja z sondą
Inkubacja z sondą
•
Odpłukanie
Odpłukanie
niezwiązanych
niezwiązanych
cząsteczek
cząsteczek
•
Wywołanie -
Wywołanie -
uwidocznienie miejsc
uwidocznienie miejsc
powiązania sondy
powiązania sondy
z badaną próbą
z badaną próbą
Western
Western
blotting
blotting
Analiza całych cząsteczek
Analiza całych cząsteczek
DNA:
DNA:
Polimorfizm Konformacji
Polimorfizm Konformacji
Jednoniciowej (SSCP)
Jednoniciowej (SSCP)
•
W przypadku braku specyficznej
W przypadku braku specyficznej
sekwencji porównuje się całe
sekwencji porównuje się całe
cząsteczki DNA
cząsteczki DNA
•
Zmiana właściwości fizyko-
Zmiana właściwości fizyko-
chemicznych DNA
chemicznych DNA
spowodowana różnicami składu
spowodowana różnicami składu
nukleotydowego
nukleotydowego
•
Wykorzystanie różnic
Wykorzystanie różnic
mobilności cząsteczek w żelu
mobilności cząsteczek w żelu
•
Nawet pojedyncza mutacja
Nawet pojedyncza mutacja
może powodować zmiany
może powodować zmiany
konformacji, co skutkuje zmianą
konformacji, co skutkuje zmianą
mobilności DNA
mobilności DNA
Single-strand conformational
polymorphism (SSCP) – wykrywanie
pojedynczych mutacji
PCR (Polymerase Chain
PCR (Polymerase Chain
Reaction)
Reaction)
Naśladuje zachodzącą
Naśladuje zachodzącą
in vivo
in vivo
replikację DNA
replikację DNA
i wymaga następujących składników
i wymaga następujących składników
reakcji:
reakcji:
•
matrycy DNA
matrycy DNA
•
starterów komplementarnych do końców
starterów komplementarnych do końców
wybranej sekwencji DNA
wybranej sekwencji DNA
•
czterech trójfosforanów
czterech trójfosforanów
deoksynukleotydów (dNTP)
deoksynukleotydów (dNTP)
•
termostabilnej polimerazy DNA
termostabilnej polimerazy DNA
•
jonów Mg
jonów Mg
2+
2+
Cykl reakcji PCR obejmuje
Cykl reakcji PCR obejmuje
następujące po sobie 3 etapy:
następujące po sobie 3 etapy:
•
denaturacja dupleksu DNA
denaturacja dupleksu DNA
w temp. 92
w temp. 92
o
o
C – 96
C – 96
o
o
C
C
•
hybrydyzacja starterów do
hybrydyzacja starterów do
komplementarnych miejsc na
komplementarnych miejsc na
matrycy w temp. 37
matrycy w temp. 37
o
o
C – 72
C – 72
o
o
C
C
•
wydłużanie startera przez
wydłużanie startera przez
dosyntetyzowanie kolejnych
dosyntetyzowanie kolejnych
deoksynukleotyów przy
deoksynukleotyów przy
udziale polimerazy DNA w
udziale polimerazy DNA w
temperaturze 72
temperaturze 72
o
o
C
C
Powtarzanie takich cykli daje
Powtarzanie takich cykli daje
w efekcie powielenie
w efekcie powielenie
zdefiniowanej sekwencji DNA
zdefiniowanej sekwencji DNA
Schemat cyklu w reakcji
PCR
W wyniku PCR liczba
cząsteczek DNA rośnie
w postępie
geometrycznym (po
każdym cyklu ich liczba
ulega podwojeniu). Po
zakończeniu około 30
cykli liczba kopii DNA
przekracza
kilka
milionów
.
2
n
gdzie n jest liczbą cykli
PCR przeprowadza się w bloku grzejnym
zwanym termocyklerem, gdzie ustawia się
czas i temperaturę poszczególnych cykli.
Wśród prób do reakcji PCR przygotowuje się
także kontrolę dodatnią i ujemną w celu
sprawdzenia prawidłowości przebiegającej
reakcji.
Modyfikacje metody PCR
Modyfikacje metody PCR
•
Nested PCR (wewnętrzny)
Nested PCR (wewnętrzny)
•
RT-PCR
RT-PCR
•
PCR-RFLP (polimorfizm długości
PCR-RFLP (polimorfizm długości
fragmentów restrykcyjnych)
fragmentów restrykcyjnych)
•
Real-time PCR (w czasie rzeczywistym)
Real-time PCR (w czasie rzeczywistym)
•
Multiplex PCR
Multiplex PCR
•
Qantititative PCR (ilościowy)
Qantititative PCR (ilościowy)
•
Competitive PCR (konkurujący)
Competitive PCR (konkurujący)
•
Touch-down PCR (hamowany)
Touch-down PCR (hamowany)
•
RAPD-PCR (losowa amplifikacja
RAPD-PCR (losowa amplifikacja
polimorficznego DNA)
polimorficznego DNA)
•
Booster PCR (regulowany)
Booster PCR (regulowany)
•
Race PCR
Race PCR
RT-PCR
RT-PCR
reverse transcriptase polymerase chain
reverse transcriptase polymerase chain
reaction
reaction
- badanie ekspresji genów
- badanie ekspresji genów
RNA
odwrotna
transkryptaza
cDNA
polimeraza DNA (PCR)
kopie DNA
Nested-PCR (wewnętrzny)
Nested-PCR (wewnętrzny)
•
Dwie pary starterów:
Dwie pary starterów:
Pierwsza
para
Pierwsza
para
zewnętrzna
zewnętrzna
Druga
para
Druga
para
wewnętrzna
wewnętrzna
•
Amplifikacja DNA jest
Amplifikacja DNA jest
dwuetapowa
dwuetapowa
•
Dzięki użyciu dwóch
Dzięki użyciu dwóch
par
starterów
par
starterów
zwiększona
zwiększona
specyficzność
i
specyficzność
i
czułość metody
czułość metody
Zastosowanie techniki PCR
Zastosowanie techniki PCR
DIAGNOSTYKA MIKROORGANIZMÓW (JAKOŚCIOWA I
ILOŚCIOWA):
zakażenia bakterią: Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae,
Mycobacterium tuberculosis, Borrelia burgdorferii
zakażenia pierwotniakiem Toxoplasma gondii
zakażenia wirusem HIV, CMV (cytomegalia), Herpes simplex
(opryszczka narządów płciowych), zapalenia wątroby typu B (HBV) i
typu C (HCV)
DIAGNOSTYKA CHORÓB NOWOTWOROWYCH:
diagnostyka mutacji w genach BRCA1 i BRCA2
diagnostyka ryzyka nowotworowego - mutacje genów kodujących
białka naprawcze, odpowiedzialne za nadwrażliwość na estrogeny
diagnostyka zagrożenia nowotworem szyjki macicy – wykrywanie
wirusa HPV (wiru brodawczaka ludzkiego)
DIAGNOSTYKA CHORÓB GENETYCZNYCH
mukowiscydoza
dystrofia mięśniowa (Duchennea i Beckera)
choroba Alzheimera (genotypowanie ApoE)
dziedziczna skłonność miażdżycowa
Choroba Parkinsona
CCR5 (mutacja odpowiedzialna za odporność na HIV)
DIAGNOSTYKA NIEPŁODNOŚCI MĘSKIEJ O PODŁOŻU GENETYCZNYM
(polegającej na braku plemników w nasieniu - mikrodelecje na chromosomie Y)
USTALANIE POKREWIEŃSTWA I OJCOSTWA
KRYMINALISTYKA
BADANIE ŻYWNOŚCI W KIERUNKU MODYFIKACJI GENETYCZNEJ GMO
(kukurzydza, soja, zboża, pomidory, ziemniaki, buraki cukrowe etc.) - analiza
jakościowa
i ilościowa
BADANIA MIKROBIOLOGICZNE ŻYWNOŚCI
(Staphylococcus aureus, Salmonella species, Shigella species, Listeria species)
BADANIA NAUKOWE
(biologia molekularna, biotechnologia, badania ewolucyjne, antropologia,
badania środowiskowe)
Mikrodelecje w obrębie chromosomu Y
PGD
Diagnostyka
preimplanatcyj
na
Pozwala na
genetyczną
analizę komórek
jajowych przed
zapłodnieniem
bądź też
zarodków przed
implantacją
metodą
wspomaganego
rozrodu.
Enzymy restrykcyjne
Enzymy restrykcyjne
•
Enzymy uzyskane z bakterii,
Enzymy uzyskane z bakterii,
chronią je przed obcymi
chronią je przed obcymi
cząsteczkami DNA
cząsteczkami DNA
•
Rozpoznają i przecinają 4, 6
Rozpoznają i przecinają 4, 6
rzadziej 8 nukleotydowe
rzadziej 8 nukleotydowe
sekwencje
sekwencje
•
Zamiana, delecja lub insercja
Zamiana, delecja lub insercja
jednej lub kilku par zasad może
jednej lub kilku par zasad może
spowodować brak lub nowe
spowodować brak lub nowe
miejsce cięcia dla enzymów
miejsce cięcia dla enzymów
Schemat cięcia enzymem
EcoR1
RFLP
RFLP
(Restriction Fragments
(Restriction Fragments
Length Polymorphism )
Length Polymorphism )
•
Polimorfizm długości fragmentów
Polimorfizm długości fragmentów
restrykcyjnych
restrykcyjnych
•
Różnicowanie organizmów
Różnicowanie organizmów
•
Badanie pokrewieństwa
Badanie pokrewieństwa
•
Różnica długości fragmentów DNA
Różnica długości fragmentów DNA
pociętych enzymami
pociętych enzymami
restrykcyjnymi
restrykcyjnymi
1.AT
1.AT
CGAG
CGAG
TTACCCGGGACCT
TTACCCGGGACCT
CGAG
CGAG
TTTATATAC
TTTATATAC
2.AT
2.AT
CGAG
CGAG
TTACCCGGGACCTCG
TTACCCGGGACCTCG
G
G
GTTTATATAC
GTTTATATAC
3.AT
3.AT
CGAG
CGAG
TTACC
TTACC
CG
CG
A
A
G
G
ACCT
ACCT
CGAG
CGAG
TTTATATAC
TTTATATAC
4.AT
4.AT
CGAG
CGAG
TTACC
TTACC
T
T
GGGACCT
GGGACCT
CGAG
CGAG
TTTATATAC
TTTATATAC
Schemat elektroforezy
Schemat elektroforezy
PCR – RFLP
PCR – RFLP
mukowiscydoza
mukowiscydoza
Fingerprint
Fingerprint
•
VNTR (
VNTR (
Variable Number of Tandem
Variable Number of Tandem
Repeats
Repeats
) zmienna liczba
) zmienna liczba
tandemowych powtórzeń
tandemowych powtórzeń
•
Zmienność sekwencji
Zmienność sekwencji
mikrosatelitarnych polega na różnej
mikrosatelitarnych polega na różnej
liczbie powtórzeń danego motywu w
liczbie powtórzeń danego motywu w
określonym locus
określonym locus
Użycie sekwencji VNTR
w medycynie sądowej
DNA fingerprinting - odcisk palca
DNA fingerprinting - odcisk palca
genomowego
genomowego
Sekwencjonowanie
Sekwencjonowanie
Metoda wykorzystywana do :
Metoda wykorzystywana do :
•
wykrywania nowych mutacji
wykrywania nowych mutacji
•
diagnostyki gatunków
diagnostyki gatunków
niedostatecznie poznanych, nowych
niedostatecznie poznanych, nowych
szczepów
szczepów
Metoda Maxama - Gilberta
Metoda Maxama - Gilberta
Metoda chemicznego zrywania wiązań,
aktualnie wyparta przez metodę
Sangera. Seria czterech reakcji
chemicznych w wyniku których DNA
przecinane jest w miejscu wystąpienia
G, A, T lub C.
Metoda
Metoda
Sangera
Sangera
Powszechnie stosowana metoda
do sekwencjonowania.
Wydłużanie łańcucha DNA
w czterech mieszaninach, z
których każda zawiera inny
ddNTP.
W każdej reakcji powstaje seria
fragmentów DNA o różnych
długościach zakończonych na
jednej z zasad.
