Inne zastosowania metod

nowoczesnej

biotechnologii

Białka rekombinowane, testy

diagnostyczne,

rekombinowane szczepionki

Systemy ekspresyjne w produkcji

rekombinacyjnych białek

• Różnorodność białek

produkowanych metodami
rekombinacyjnego DNA w dużej
mierze wynika z coraz lepszego
opracowania możliwości ekspresji
informacji genetycznej w komórkach
różnych „gospodarzy”



Bakterie

• dobrze scharakteryzowane
• łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych
• wydajne systemy ekspresyjne
• brak modyfikacji posttranslacyjnych
• możliwość

produkcji

białek

w

postaci

nierozpuszczalnych ciał inkluzyjnych

• możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających

domeny

ułatwiające

oczyszczanie

białek,

zwiększające

rozpuszczalność,

zwiększające

immunogenność

Charakterystyka gospodarzy
ekspresyjnych

Charakterystyka gospodarzy

ekspresyjnych



Drożdże

• dobrze scharakteryzowane
• łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych
• wydajne systemy ekspresyjne
• trwałe

rekombinanty

–

integracja

plazmidów

ekspresyjnych z genomem gospodarza

• modyfikacje posttranslacyjne – tworzenie mostków

disiarczkowych, glikozylacja, przyłączanie kwasów
tłuszczowych

• możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających

domeny

ułatwiające

oczyszczanie

białek,

zwiększające immunogenność

Przepływ informacji genetycznej

•

DNA  RNA białko

Ekspresja informacji genetycznej

DNA RNA

Transkrypcja

RNA białko

Translacja

U retrowirusów
RNA DNA Odwrotna transkrypcja

Charakterystyka gospodarzy

ekspresyjnych



Komórki owadzie

• systemy ekspresyjne oparte na plazmidach lub

bakulowirusie

• modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja inna niż

w komórkach ssaczych

• wrażliwe na zakażenia wirusowe



Komórki ssacze

• modyfikacje

posttranslacyjne

–

glikozylacja,

fosforylacja, przyłączanie kwasów tłuszczowych,
tworzenie mostków disiarczkowych

• droga hodowla
• stabilne produkcyjne linie komórkowe trudne do

otrzymania

Przykłady białek produkowanych

metodami rekombinacyjnego DNA

• Insulina
• Ludzki hormon wzrostu
• Tkankowy aktywator plazminogenu
• Czynnik krzepliwości krwi

Ludzki hormon wzrostu (hGH)

• Ludzki hormon wzrostu (hGH) -

produkowany w komórkach bakteryjnych na

dwa sposoby. Skonstruowano wektor

ekspresyjny używając cDNA kodującego

większość aminokwasów i dodano

syntetyczny oligonukleotyd początkowy.

Hormon był eksprymowany

wewnątrzkomórkowo.

• Drugim sposobem było dodanie na początku

genu sekwencji sygnałowej, która

umożliwiła transport białka do przestrzeni

peryplazmatycznej skąd łatwo można było

uwolić hormon za pomocą dysrupcji

hypotonicznej zewnętrznej błony.

Tkankowy aktywator

plazminogenu (tPA)

• Tkankowy aktywator plazminogenu

(ang. tissue plasminogen activator, PLAT,

tPA) – wydzielana przez śródbłonek

proteaza serynowa przekształcająca

proenzym plazminogen w plazminę.

• tPA odgrywa rolę w migracji komórek i

przebudowie tkanek. Zwiększona

aktywność enzymatyczna tkankowego

aktywatora plazminogenu powoduje

zwiększoną fibrynolizę, objawiającą się

nadmiernym krwawieniem; obniżona

aktywność sprzyja zakrzepicy i zatorom.

Tkankowy aktywator

plazminogenu (tPA)

• Rekombinowane tkankowe

aktywatory plazminogenu (rtPA)
znajdują zastosowanie w
leczeniu stanów
predysponujacych do tworzenia
zakrzepów, takich jak udar
mózgu albo zawał mięśnia
sercowego.

Tkankowy aktywator

plazminogenu (tPA)

• Tkankowy aktywator plazminogenu

(tPA) jest produkowany komercyjnie w

ssaczych kulturach komórkowych.

Sklonowano ludzkie cDNA tego genu,

wstawiono pod silny promotor i

terminator. Wektorem została stabilnie

stransfekowana

linia komórek

ssaczych.

Linie wysoko eksprymujące

to białko hodowane są w dużych

fermentatorach a zrekombinowany tPA

jest oczyszczany z pożywki.

Czynnik VIII krzepnięcia krwi

• Czynnik VIII , niezbędny do

prawidłowego krzepnięcia krwi , jest

także produkowany przez ssacze

komórki. Od wielu lat hemofilitykom

podawano ten czynnik oczyszczany z

ludzkiej krwi. Przyczyniło się to w

pewien sposób do rozszerzenia

pandemii AIDS. Obecnie cDNA genu tego

białka zostało sklonowane. Podobnie jak

tPA czynnik VIII jest dużym kompleksem

białkowym , który prawidłowo może być

składany i produkowany tylko w

komórkach ssaczych.

Szczepionki

Tradycyjne i

rekombinowane

Szczepionki tradycyjne

• Jako szczepionki wykorzystywano

tradycyjnie

• --Preparaty zawierające żywy

organizm patogenny osłabiony dzięki

wielokrotnym pasażom w hodowlach

• --Preparaty zawierające martwy

organizm patogenny

• --Preparaty zawierające

immunogenne epitopy organizmu

patogennego

NIEBEZPIECZEŃSTWO!

• --mogło dojść do ponownego

uaktywnienia organizmu
patogennego

• --zabicie wszystkich

chorobotwórczych organizmów
mogło się nie udać

Definicje/patogen

Patogen, czynnik chorobotwórczy

– ciało obce,

twór biologiczny czy mikroorganizm wywołujący

chorobę u danego organizmu. Wyróżnia się

następujące typy patogenów:

• ożywione (

bakterie, wirusy, "robaki

pasożytnicze

")

• psychiczne

• nieożywione:

– chemiczne (

substancje żrące, toksyczne

),

– fizyczne (

światło lasera, promieniowanie jonizujące,

silne pole magnetyczne, mechaniczne

).

– Zazwyczaj pojęcie to odnosi się do

czynników

biologicznych

.

Definicje/przeciwciała

• Przeciwciała lub

immunoglobuliny – białka
wydzielane przez komórki
plazmatyczne (czyli pobudzone
limfocyty B) w przebiegu odpowiedzi
immunologicznej typu humoralnego,
które mają zdolność do swoistego
rozpoznawania

antygenów

.

Budowa przeciwciała

Schemat budowy przeciwciał
1. Fragment Fab
2. Fragment Fc
3. Łańcuch ciężki
4. Łańcuch lekki
5. Miejsce wiązania antygenu
6. Regiony zawiasowe

Przeciwciała

• Przeciwciała (immunoglobuliny) mają

kształt litery Y i składaja się z czterech

łańcuchów polipeptydowych połączonych

wiązaniami disiarczkowymi.

• Dwa identyczne

łańcuchy lekkie (L)

zbudowane są z około 220 aminokwasów

• Dwa identyczne

łańcuchy ciężkie (H)

zbudowane są z około 440

aminokwasów.

• Przeciwciało zawiera dwa miejsca

wiązania z antygenem (oznacza to, że

przeciwciało jest dwuwartościowe)

Przeciwciała

Definicje/ antygen

• Antygenem (gr. ἀντί anti - przeciw,

γένος genos - ród, rodzaj; przytaczane
także ang. antigen =

antibody

generator

, generator przeciwciał) może

być każda substancja, która wykazuje
dwie cechy:

immunogenność

, czyli

zdolność wzbudzenia przeciwko sobie
odpowiedzi odpornościowej swoistej,
oraz

antygenowość

, czyli zdolność do

reagowania z

przeciwciałami

.

Definicje/epitop

• Epitopem

lub

determinantą antygenową

nazywamy fragment

antygenu

, który łączy

się bezpośrednio z

przeciwciałem

.

• Dany epitop może silniej lub słabiej

pobudzać

układ odpornościowy

. Te

epitopy danego antygenu, które wywołują
najsilniejszą

odpowiedź odpornościową

u

danego gatunku lub osobnika noszą nazwę

determinant immunodominujących

Szczepionki wytwarzane

metodami inżynierii

genetycznej

• Do wytwarzania szczepionek używa

się

• ---organizmów patogennych

nieodwracalnie

osłabionych

przez

delecję określonych genów

• ---wektorów pochodzenia wirusowego

zrekombinowanych z genami

kodującymi immunogenne białka

organizmu patogennego

• ---preparatów immunogennych

peptydów i białek uzyskanych

metodami inżynierii genetycznej

Tego typu szczepionki są

znacznie bardziej

bezpieczne!!

• Głównym problemem w

konstruowaniu szczepionek
zawierających antygeny
powierzchniowe (zazwyczaj
glikoproteiny płaszcza wirusa lub
błony komórkowej bakterii) jest
właściwa prezentacja antygenu
w formie przypominającej jego
natywną konformację

Szczepionka przeciw HBV

• Przykładem może być

szczepionka przeciw HBV,
wirusowi powodującemu ostre i
chroniczne zapalenie wątroby
typu B (hepatitis B)

Szczepionki przeciwko

wirusowemu zapaleniu wątroby

typu B

Czynnik etiologiczny – wirus

HBV

 Rodzina: Hepadnaviridae

 Rodzaj: Orthohepadnavirus
 Struktura:

ikosaedralny

nukleokapsyd

otoczony

podwójną osłonką; kulisty; śr. 42
nm

 Kwas nukleinowy: DNA
 Replikacja: hepatocyty
 Rezerwuar: człowiek

Szczepionki przeciwko

wirusowemu zapaleniu wątroby

typu B

 Droga przenoszenia: krew i

płyny

ustrojowe,

w

tym

wydzielina

szyjki

macicy,

nasienie



Wysoka zakaźność – nawet 0,1

μl

krwi

może

spowodować

zakażenie

 Hodowla

w

warunkach

laboratoryjnych – nie zakaża

zarodków kurzych i powszechnie

stosowanych linii komórkowych

We krwi do 10

10

wirusów/ml

Szczepionki przeciwko

wirusowemu zapaleniu wątroby

typu B

Antygeny wirusa HBV

 HBcAg – białko rdzenia
 HBeAg – białko rdzenia


HBsAg – białko powierzchniowe

• tworzy zewnętrzną osłonkę wirusa
• nadmiar białka obecny we krwi w

postaci

kulistych

lub

pałeczkowatych agregatów

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Odpowiedź immunologiczna

na zakażenie HBV

 Odpowiedź humoralna

• przeciwciała anty-HBsAg (preS1,

preS2 i S)

• przeciwciała anty-HBcAg
• przeciwciała anty-HBeAg

 Odpowiedź komórkowa

• limfocyty Tc

Szczepionka przeciw HBV

• Wirus HBV ma niewielki genom (3182

nukleotydy) a jego kapsyd

zbudowany jest z glikoproteiny

HBsAg.

• Hepatocyty (komórki wątroby)

chorego wydzielają do krwi sferyczne,

nieinfekcyjne twory o średnicy 22 nm

zbudowane z HBsAg i lipidów oraz

zakaźne cząstki o średnicy 42 nm,

zawierające DNA wirusa.

Szczepionka przeciw HBV

• Do początku lat 80-tych jedyną

szczepionka przeciw HBV był preparat
inaktywowanych formaliną cząstek 22
nm.

• Ilość tej szczepionki była uzależniona

od dostępności zainfekowanej surowicy
i koniecznością przestrzegania bardzo
rygorystycznych procedur
wykluczających obecność innych
elementów infekcyjnych.

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Gen kodujący antygen HBsAg – koduje 3
polipeptydy
 preS1
 preS2
 S

Szczepionki przeciwko

wirusowemu zapaleniu wątroby

typu B

Szczepionki II generacji

(rekombinowane)

Pierwsza szczepionka

zarejestrowana w 1986 r.

 Substancja czynna – białkowy

antygen powierzchniowy HBsAg

• białko S

 Sposób

otrzymywania

–

produkcja

białka

S

w

komórkach

drożdży

S.

cerevisiae

Szczepionki przeciwko wirusowemu

zapaleniu wątroby typu B

Szczepionki II

generacji

(rekombinowane)

Pierwszy układ

ekspresyjny opublikowany

w 1982 r.

(P. Valenzuela,

A. Medina, W.J. Rutter, Nature,

289, 347 – 350)

 wektor ekspresyjny – pHBS-

16

• autonomiczna replikacja

• ori replikacji pBR322
• gen oporności na ampicylinę
• ori replikacji plamidu 2μ
• gen trp1
• sekwencja kodująca białko S

pod kontrolą promotora ADH I

dehydrogenazy alkoholowej I

Szczepionki przeciwko

wirusowemu zapaleniu wątroby

typu B

Szczepionki II generacji

(rekombinowane)

 Adiuwant – wodorotlenek glinu
 Postać szczepionki – płynna
 Temperatura przechowywania – 2-8°C
 Sposób podawania – domięśniowo
 Dawkowanie – 3 dawki (1 - dzień 0; 2 – po 6

tyg.; 3 – po 6 m-cach od pierwszego

szczepienia)

 Skuteczność szczepionki

Szczepionka przeciw HBV

• Konstruując szczepionkę

metodami inżynierii genetycznej,
wprowadzono do plazmidu
sekwencję kodującą HBsAg (835
zasad). Uzyskano dobry poziom
ekspresji i produkt wykazywał
właściwości immunologiczne
podobne do cząstek 22 nm.

Szczepionka przeciw HBV

• Właściwości immunogenne

ulepszono poprzez wprowadzenie

przed genem HBsAg tzw.

sekwencji pre-S (sekwencja

kodująca 55 aminokwasy

współdziałające w rozpoznawaniu

hepatocytów przez wirusa).

• Szczepionka ta wykazała dużą

skuteczność w testach grup

wysokiego ryzyka

Bezpieczne szczepionki

• Wytwarzanie bezpiecznych

szczepionek w oparciu o
wykorzystanie wirusa krowianki
jako biorcy obcego DNA

Szczepionka przeciwko ospie

prawdziwej

pierwsza szczepionka wynaleziona przez

człowieka

W 1796 roku Edward Jenner,

praktykujący na wsi angielski lekarz,

odkrył pierwszą na świecie

szczepionkę.

Zaobserwował,

że

kobiety

Zaobserwował,

że

kobiety

zatrudnione przy dojeniu krów, które

zatrudnione przy dojeniu krów, które

miały na rękach blizny spowodowane

miały na rękach blizny spowodowane

ospą krowią, nie chorowały na ospę

ospą krowią, nie chorowały na ospę

prawdziwą, nawet przebywając wśród

prawdziwą, nawet przebywając wśród

chorych na ospę prawdziwą członków

chorych na ospę prawdziwą członków

rodziny.

rodziny.

Szczepionka przeciwko ospie

prawdziwej

pierwsza szczepionka wynaleziona przez

człowieka



14 maja 1796 r. Edward
Jenner

zaszczepił

ośmioletniego chłopca Jamesa
Phippsa wirusem ospy krowiej
pochodzącym z krost na
rękach dojarki Sarah Nelmes



7 tygodni później Jenner
inokulował Phippsa wirusem
ospy prawdziwej

chłopiec nie zachorował

chłopiec nie zachorował

W ten sposób narodziło się szczepienie nazwane przez E.

W ten sposób narodziło się szczepienie nazwane przez E.

Jennera vaccination (od łac.

Jennera vaccination (od łac.

vacca

vacca

– krowa).

– krowa).

Wirus krowianki

• Zalety wirusa krowianki
• --- brak cech chorobotwórczych

dla człowieka

• --- łatwe namnażanie się w

hodowlach komórkowych in vitro

• ---jest to wirus najdłużej

stosowany jako szczepionka

uodparniająca ludzi przed ospą

ludzką

Wirus krowianki

• E. Jenner użył przeszło 200 lat temu

wirusa krowianki jako szczepionki
przeciw czarnej ospie (szczepień
zaniechano w 1980 roku)

• Wirusa krowianki używa się szeroko do

wytwarzania żywych, poliwalentnych
szczepionek dla ludzi i zwierząt.

• Wirus krowianki posłużył do

opracowania innej strategii produkcji
szczepionki przeciw HBV.

Szczepionka przeciw HBV

skonstruowana w oparciu

wykorzystanie wirusa krowianki

.

• Sklonowany w plazmidzie bakteryjnym

gen HBsAg otoczony sekwencjami wirusa

krowianki i wprowadzony do komórek

zainfekowanych wirusem krowianki ulega

homologicznej rekombinacji z DNA wirusa.

• Rekombinacją steruje się w taki sposób

aby zachodziła w regionach sekwencji

nieistotnych dla cyklu życia wirusa.

Długość takich sekwencji sprawia, ze

wirus krowianki może być jednocześnie

zrekombinowany z wieloma genami

(możliwość produkcji szczepionek

poliwalentnych

).

Szczepionka przeciw HBV

skonstruowana w oparciu

wykorzystanie wirusa krowianki

.

• Szczepionka otrzymana w

oparciu o wirusa krowianki
okazała się skuteczna,
prowadząc do wytworzenia
odpowiednich specyficznych
przeciwciał.

Zalety szczepionek

rekombinowanych

• Szczepionki otrzymywane metodami

rekombinacji DNA są stabilne a
proces wytwarzania jest bezpieczny.
Preparaty te można stosunkowo
szybko modyfikować i dostosowywać
do ewentualnych zmian cech
patogennego organizmu.

Diagnostyka

Polimorfizm długości fragmentów

restrykcyjnych

• RFLP - polimorfizm długości fragmentów

restrykcyjnych. Indywidualne genomy
ludzkie różnią się między sobą - występuje
polimorfizm genetyczny. Odcinki DNA
uzyskane po trawieniu restryktazami są
charakterystyczne dla każdego genomu.
Udało się w przypadku niektórych chorób o
podłożu genetycznym skorelować mutację
powodującą stratę bądź uzyskanie miejsca
restrykcyjnego z występowaniem choroby.

Diagnostyka fenyloketonurii

• Fenyloketonuria: choroba polegajaca na

zaburzeniu w przemianie aminokwasów
aromatycznych, związana z niedoborem
hydrolazy fenyloalaninowej (PAH).

• Gen PAH występuje w jednej kopii i

składa się z 13 egzonów (eksonów) o
długości sumarycznej 2.3 kpz i 12
intronów o długości sumarycznej 85
kpz.

Diagnostyka fenyloketonurii

• Fenyloketonuria to wynik

zamiany jednego aminokwasu
(argininy na tryptofan jako wynik
pojedynczej mutacji C--->T w
egzonie 12-tym).

Diagnostyka fenyloketonurii

• Gen PAH ulega ekspresji w wątrobie i dlatego

nie można do wykrycia fenyloketonurii

zastosować klasycznych metod diagnostyki

prenatalnej (poszukiwanie odpowiednich

białek w hodowlach komórek płodu i komórek

płynu owodniowego).

• Test wykonuje się po urodzeniu. Terapia

zachowawcza (dieta uboga w aminokwasy

aromatyczne) wprowadzona zaraz po

urodzeniu pozwala na unikniecie

nieodwracalnych uszkodzeń tkanki mózgowej

wywołanej toksycznymi produktami

niewłaściwego metabolizmu fenyloalaniny

Diagnostyka fenyloketonurii

• W badaniach DNA członków

rodzin obciążonych
fenyloketonurią znaleziono
polimorfizm restrykcyjny obszaru
genu PAH dla ośmiu enzymów
restrykcyjnych m.in. MspI. Użycie
tego enzymu do analizy pozwala
na postawienie diagnozy z 98.5%
pewnością'

Koniec

• DIAGNOSTYKA FENYLOKETONURII
• Fenyloketonuria: choroba polegajaca na

zaburzeniu w przemianie aminokwasów
aromatycznych, zwiazana z niedoborem
hydrolazy fenyloalaninowej (PAH).

• Gen PAH występuje w jednej kopii i

składa się z 13 egzonów (eksonów) o
dlugości sumarycznej 2.3 kpz i 12
intronów o długości sumarycznej 85
kpz.

• Fenyloketonuria to wynik

zamiany jednego aminokwasu
(argininy na tryptofan jako wynik
pojedynczej mutacji C--->T w
egzonie 12-tym).

• Gen PAH ulega ekspresji w wątrobie i dlatego

nie można do wykrycia fenyloketonurii

zastosować klasycznych metod diagnostyki

prenatalnej (poszukiwanie odpowiednich

białek w hodowlach komórek płodu i komórek

płynu owodniowego). Test wykonuje się po

urodzeniu. Terapia zachowawcza (dieta

uboga w aminokwasy aromatyczne)

wprowadzona zaraz po urodzeniu pozwala na

unikniecie nieodwracalnych uszkodzeń tkanki

mózgowej wywołanej toksycznymi

produktami niewłaściwego metabolizmu

fenyloalaniny

• W badaniach DNA członków

rodzin obciążonych
fenyloketonurią znaleziono
polimorfizm restrykcyjny obszaru
genu PAH dla ośmiu enzymów
restrykcyjnych m.in. MspI. Użycie
tego enzymu do analizy pozwala
na postawienie diagnozy z 98.5%
pewnością'