METODA ROZDZIŁU

CHARAKTERYSTYKA

MOLEKULARNA

WŁAŚCIWOŚCI

FIZYKOCHEMICZNE

Chromatografia

gazowo-cieczowa

Polarność

Lotność

Chromatografia

cieczowo-cieczowa

Rozpuszczalność

Chromatografia ciało

stałe-ciecz

Adsorbcja

Chromatografia

jonowymienna

Charakter jonowy

Ładunek wypadkowy

Elekrtoforeza

Chromatografia

żelowa

Wielkość

(ciężar cząsteczkowy)

Dyfuzja

Dializa

Ultrawirowanie

Sedymentacja

Chromatografia

powinowactwa

Wiązanie ligandów

Kształt cząsteczki

WPŁYW WŁASNOŚCI FIZYKOCHEMICZNYCH ANALIZOWANYCH BIOMOLEKUŁ NA WYBÓR METODY ROZDZIAŁU MIESZANIN

CHROMATOGRAFIA

CIECZOWA

Chromatografia cieczowa - rodzaj

chemicznej techniki analitycznej -

chromatograficznej, w której eluentem -

czynnika przenoszącego analizowaną

mieszaninę, jest ciecz, zwykle jakiś

rozpuszczalnik. Istotą każdej chromatografii

cieczowej jest rozdział analizowanej

mieszaniny na poszczególne związki

chemiczne poprzez przepuszczanie roztworu

tej mieszaniny przez stałe lub żelowe złoża,

co w pewnym sensie przypomina filtrację. Na

skutek oddziaływań międzycząsteczkowych

między związkami tworzącymi mieszaninę a

złożem jedne z nich przechodzą przez złoże

szybciej a inne wolniej.

Najstarsza z metod

chromatograficz

nych, klasyczna

chromatografia

cieczowa,

przeżywa

obecnie swój

renesans dzięki

nowym

rozwiązaniom,

skracającym

czas analizy i

zwiększającym

zdolność

rozdzielczą.

METODA

BADAWCZA

CZAS

ANALIZY

LC

(klasyczna)

1-20 h

GC

(gazowa)

od kilku sek.

do kilku min.

HPLC

(wysokosprawna

chromatografia

cieczowa)

1-60 min.

W ZALEŻNOŚCI OD RODZAJU FAZY

STACJONARNEJ WYRÓŻNIAMY:

 CHROMATOGRAFIĘ CIECZ – CIAŁO STAŁE (LSC)

(liquid-solid chromatography)

 CHROMATOGRAFIĘ CIECZ – CIECZ (LLC)

(

liquid-

liquid chromatography)

 CHROMATOGRAFIĘ JONOWYMIENNĄ (IC)

 CHROMATOGRAFIĘ ŻELOWĄ (GPC)

 CHROMATOGRAFIĘ POWINOWACTWA (AC)

WSPÓŁCZESNA CHROMATOGRAFIA

CIECZOWA JEST OKREŚLANA JAKO:

 WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA

(HPLC)

(High-performance liquid chromatography)

 WYSOKOCIŚNIENIOWA CHROMATOGRAFIA

CIECZOWA (HPLC)

(high-pressure liquid chromatography)

 SZYBKA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA

 CHROMATOGRAFIA CIECZOWA O DUŻEJ

ZDOLNOŚCI ROZDZIELCZEJ

HPLC

różni się od zwykłej chromatografii cieczowej

ciśnieniem pod jakim podawany jest eluent na

kolumny. Są to dość znaczne ciśnienia,

przekraczające 100 atm. Dzięki takiemu ciśnieniu

złoże w kolumnach HPLC może być bardziej

"upakowane" niż w kolumnach do zwykłej,

niskociśnieniowej chromatografii cieczowej, co

powoduje znacznie lepszy rozdział analizowanych

mieszanin na poszczególne związki chemiczne, w

znacznie krótszym czasie, przy mniejszym zużyciu

eleunta i mniejszej ilości analizowanej próbki.

Zdolności rozdzielcze HPLC są zbliżone, a nawet

czasem większe od zdolności rozdzielczych

chromatografii gazowej.

ZASTOSOWANIE WYSOKOŚCIENNEJ

CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ:

 związki biologicznie czynne: białka,

polipeptydy, aminokwasy, polisacharydy,

witaminy, sterydy, kwasy nukleinowe i ich

składniki

 preparaty farmaceutyczne

 węglowodory policykliczne, w tym rakotwórcze

[benzo(a)piren] w powietrzu atmosferycznym,

wodzie i w środkach spożywczych

 związki metaloorganiczne i związki

kompleksowe

 aniony nieorganiczne metodą chromatografii

jonów

Chromatografia jonowymienna

• W tej metodzie faza stacjonarna, złoże, jest

obdarzona ładunkiem. Stanowi je zazwyczaj żywica

jonowymienna, zawierająca obdarzone ładunkiem

grupy funkcyjne, oddziałujące z przeciwnie

naładowanymi grupami związków, które mają zostać

zatrzymane przez nośnik:

• pozytywnie naładowany jonowymieniacz (anionit)

wiąże aniony,negatywie naładowany jonowymieniacz

(kationit) wiąże kationy.

• Związki związane z jonowymieniaczem mogą być

wymyte z kolumny przez stopniową elucję, a także

poprzez zmianę stężenia soli lub pH.

• Tego rodzaju chromatografii używa się do oddzielania

takich związków jak aminokwasy, peptydy i białka.

Chromatografia jonowymienna jest powszechnie

stosowana do oczyszczania białek w systemie FPLC.

CHROMATOGRAFIA POWINOWACTWA

polega na wykorzystywaniu

specyficznych reakcji chemicznych

pomiędzy reaktywnymi chemicznie

ligandami związanymi z powierzchnią

adsorbentu, a nietypowymi

składnikami roztworu rozdzielanego.

wykorzystuje zdolność białek do

swoistych wiązań: Enzymów z ich

substratami Receptorów z ligandami

Przeciwaciał z antygenami.

FAZY RUCHOME W CHROMATOGRAFI

CIECZOWEJ

W chromatografii cieczowej faza ruchoma

wywiera decydujący wpływ na zdolność

rozdzielczą układu. Rozpuszczalniki stosowane

jako fazy ruchome w HPLC powinny:

 wykazywać odpowiednią zdolność rozpuszczania

próbki

 charakteryzować się wysokim stopniem czystości
 nie reagować chemicznie ani z fazą stacjonarną, ani z

rozdzielaną próbką

 charakteryzować się trwałością w warunkach

chromatografowania

 być tanie