TECHNIKI

TECHNIKI

MOLEKULARNE

MOLEKULARNE

SŁUŻĄCE DO

SŁUŻĄCE DO

WYKRYWANIA DUŻYCH

WYKRYWANIA DUŻYCH

PRZEMIESZCZEŃ

PRZEMIESZCZEŃ

ANALIZY MOLEKULARNE

ANALIZY MOLEKULARNE

pozwalają na wykrycie osób

pozwalają na wykrycie osób

z wysokim ryzykiem

z wysokim ryzykiem

zachorowania na nowotwory

zachorowania na nowotwory

(bezobjawowych

nosicieli

(bezobjawowych

nosicieli

mutacji).

Umożliwia

to

mutacji).

Umożliwia

to

skuteczną

i

tańszą

skuteczną

i

tańszą

profilaktykę.

profilaktykę.

BADANIE DNA

BADANIE DNA

IZOLACJA DNA

PCR

SEKWENCJONOWANIE

METODY PRZESIEWOWE

MUTACJE

MUTACJE

1. SUBSTYTUCJE( tranzycje..,
transwersje.-)

a) „missense” - zmiana aminokwasu

b) „nonsense” - powstanie
przedwczesnego
kodonu stop
c)mutacja milcząca-brak zmiany
aminokwasu

2. DELECJE I INSERCJE

a) z przesunięciem ramki odczytu

b) bez przesunięcia ramki odczytu

3. Inwersje (odwrócenia)

3. Inwersje (odwrócenia)

4. Translokacje (przeniesienia)

4. Translokacje (przeniesienia)

TYPY MUTACJI ZE

TYPY MUTACJI ZE

WZGLĘDU

WZGLĘDU

NA ICH WIELKOŚĆ

NA ICH WIELKOŚĆ

1. MAŁE MUTACJE

1. MAŁE MUTACJE

a) substytucje

a) substytucje

b) insercje < 100 pz

b) insercje < 100 pz

c) delecje < 100 pz

c) delecje < 100 pz

2. DUŻE MUTACJE (PRZEMIESZCZENIA)

2. DUŻE MUTACJE (PRZEMIESZCZENIA)

a) delecje (wypadnięcia fragmentu genu) >

a) delecje (wypadnięcia fragmentu genu) >

100 pz

100 pz

b) insercje (wstawienia) > 100 pz

b) insercje (wstawienia) > 100 pz

c) inwersje (odwrócenia)

c) inwersje (odwrócenia)

d) translokacje (przeniesienia)

d) translokacje (przeniesienia)

METODY

METODY

WYKRYWANIA MUTACJI

WYKRYWANIA MUTACJI

1. MAŁYCH

2. ZNANYCH

3. DUŻYCH

TECHNIKI MOLEKULARNE

TECHNIKI MOLEKULARNE

SŁUŻĄCE DO WYKRYWANIA

SŁUŻĄCE DO WYKRYWANIA

DUŻYCH PRZEMIESZCZEŃ

DUŻYCH PRZEMIESZCZEŃ

1. SOUTHERN BLOTING
2.

Multipleks PCR z

Multipleks PCR z

fluorescencyjnymi

fluorescencyjnymi

primerami

primerami

3.

ANALIZY RNA

ANALIZY RNA

4. LOH
5. LONG PCR
6. MLPA
7. MAPH

SOUTHERN BLOTING -

SOUTHERN BLOTING -

metoda opisana w 1975 r

metoda opisana w 1975 r

W tej metodzie genomowe DNA poddaje
się trawieniu enzymami restrykcyjnymi,
by następnie powstałe fragmenty,
rozdzielić elektroforetycznie. W celu
uzyskania formy jednoniciowej poddaje
się je denaturacji i przenosi na filtr
nitrocelulozowy bądź nylonowy. Związany
z filtrem jednoniciowy DNA hybrydyzuje
z sondą (DNA wyznakowany i
komplementarny do badanego fragmentu
).
W sytuacji gdy występuje duża mutacja
układ prążków jest odmienny niż w
próbkach bez mutacji.

SOUTHERN BLOTING

SOUTHERN BLOTING

genomowe DNA

trawienie enzymami restrykcyjnymi

rozdział elektroforetyczny

denaturacja dwuniciowego DNA

transfer na filtr nitrocelulozowy bądź nylonowy

hybrydyzacja jednoniciowego DNA z sondą

analiza autoradiogramu (duża mutacja - układ

prążków

jest odmienny niż w próbkach bez mutacji)

G.K.

Rys.1a Zasada SSCP

Schematic presentation of the blotting procedure

gel containing separated DNA

fragments

gel

membrane

membrane

membrane

transfer from gel to membrane

identical position of fragments

hybridization with radioactively

labelled DNA

radioautograph of hybrid DNA

DETEKCJA

DETEKCJA

W wersji z użyciem izotopów obraz

W wersji z użyciem izotopów obraz

prążków wywołuje się metodą

prążków wywołuje się metodą

autoradiografii, przykładając błonę

autoradiografii, przykładając błonę

fotograficzną do filtra w celu

fotograficzną do filtra w celu

zidentyfikowania pozycji prążków

zidentyfikowania pozycji prążków

zajętych przez sondę.

zajętych przez sondę.

DETEKCJA

DETEKCJA

Pozycja i intensywność prążków DNA

Pozycja i intensywność prążków DNA

kontrolnego i zmutowanego różnią się

kontrolnego i zmutowanego różnią się

między sobą .

między sobą .

Duże przemieszczenia DNA

Duże przemieszczenia DNA

a) (delecje > 100 pz

a) (delecje > 100 pz

b) insercje > 100 pz

b) insercje > 100 pz

c) Inwersje

c) Inwersje

d) translokacje

d) translokacje

zmieniają odległości pomiędzy miejscami

zmieniają odległości pomiędzy miejscami

restrykcyjnymi, tym samym zmienia się

restrykcyjnymi, tym samym zmienia się

długość analizowanych fragmentów.

długość analizowanych fragmentów.

•

Multipleks PCR z fluorescencyjnymi

Multipleks PCR z fluorescencyjnymi

primerami- kolejną metodą używaną do

primerami- kolejną metodą używaną do

wykrywania dużych przemieszczeń.

wykrywania dużych przemieszczeń.

Metoda Southerna jest czaso- i

Metoda Southerna jest czaso- i

pracochłonna.

pracochłonna.

Wymaga dużych ilości

Wymaga dużych ilości

długocząsteczkowego DNA

długocząsteczkowego DNA

Metoda Southerna może być zastąpiona

Metoda Southerna może być zastąpiona

techniką opartą o

techniką opartą o

Multipleks PCR z

Multipleks PCR z

fluorescencyjnymi primerami

fluorescencyjnymi primerami

Multipleks PCR z

Multipleks PCR z

fluoroscencyjnymi primerami

fluoroscencyjnymi primerami

Równoczesna amplifikacja ilościowa

Równoczesna amplifikacja ilościowa

wielu fragmentów wielu fragmentów

wielu fragmentów wielu fragmentów

genu badanego i jednego fragmentu

genu badanego i jednego fragmentu

genu odniesienia.

genu odniesienia.
Zmiany stosunków ilościowych
poszczególnych fragmentów
pozwalają wnioskować o delecjach lub
duplikacjach odpowiednich odcinków
genów

Analizy RNA

Analizy RNA

Multipleks PCR z fluoroscencyjnymi

Multipleks PCR z fluoroscencyjnymi

primerami może być obarczony błędem

primerami może być obarczony błędem

wynikającym z różnego stopnia

wynikającym z różnego stopnia

degradacji próbek DNA. Ilościowe

degradacji próbek DNA. Ilościowe

zmiany mogą mieć charakter

zmiany mogą mieć charakter

artefaktów.

artefaktów.

Brakuje metod służących rutynowemu

Brakuje metod służących rutynowemu

wykrywaniu dużych przemieszczeń.

wykrywaniu dużych przemieszczeń.

W tym celu pomocne mogą być

W tym celu pomocne mogą być

badania RNA

badania RNA

Analiza

Analiza

RNA

RNA

Izolacja RNA metodą P.Chomczynskiego: -liza limfocytów

Izolacja RNA metodą P.Chomczynskiego: -liza limfocytów

krwi w roztworze rodanku guanidyny (inhibitor RNA-az

krwi w roztworze rodanku guanidyny (inhibitor RNA-az

-

-

ekstrakcja mieszaniną fenolu i chloroformu.

ekstrakcja mieszaniną fenolu i chloroformu.

RT/PCR-odwrotna transkrypcja z reakcją PCR

RT/PCR-odwrotna transkrypcja z reakcją PCR

-transkrypcja RNA na komplementarny DNA( RNA po

-transkrypcja RNA na komplementarny DNA( RNA po

splicingu<składaniu> pozbawione intronów)

splicingu<składaniu> pozbawione intronów)

-amplifikacja cDNA przy pomocy reakcji PCR

-amplifikacja cDNA przy pomocy reakcji PCR

-Detekcja na żelach agarozowych –wykrycie dużych delecji,

-Detekcja na żelach agarozowych –wykrycie dużych delecji,

insercji

insercji

Test syntezy białka in vitro –IVTT (In Vitro Transcription

Test syntezy białka in vitro –IVTT (In Vitro Transcription

Translation Assay)

Translation Assay)

- RT/PCR

- RT/PCR

- synteza białka in vitro

- synteza białka in vitro

- rozdział elektroforetyczny

- rozdział elektroforetyczny

- przeniesienie na błonę nitrocelulozową i ocena długości

- przeniesienie na błonę nitrocelulozową i ocena długości

zsyntetyzowanego białka , zmienionej w przypadku

zsyntetyzowanego białka , zmienionej w przypadku

występowania mutacji

występowania mutacji

WŚRÓD

WŚRÓD

DZIEDZICZNYCH

DZIEDZICZNYCH

PRZYCZYN

PRZYCZYN

NOWOTWORÓW GŁÓWNIE ROZPOZNAWANA

NOWOTWORÓW GŁÓWNIE ROZPOZNAWANA

JEST PREDYSPOZYCJA

JEST PREDYSPOZYCJA

JEDNOGENOWA

JEDNOGENOWA

Z

Z

CECHAMI DZIEDZICZENIA

CECHAMI DZIEDZICZENIA

AUTOSOMALNIE

AUTOSOMALNIE

DOMINUJĄCEGO

DOMINUJĄCEGO

W tym typie chorób genetycznych

W tym typie chorób genetycznych

mutacje konstytucyjne

mutacje konstytucyjne

(tj. obecne we

(tj. obecne we

wszystkich komórkach organizmu)

wszystkich komórkach organizmu)

w

w

pojedynczym genie są główną

pojedynczym genie są główną

przyczyną zachorowania.

przyczyną zachorowania.

We wszystkich nowotworach występują

We wszystkich nowotworach występują

mutacje genów, są to jednak tzw.

mutacje genów, są to jednak tzw.

mutacje somatyczne

mutacje somatyczne

,

,

występujące

występujące

jedynie w tkance nowotworowej.

jedynie w tkance nowotworowej.

LOH (Loss Of Heterozygosity).

LOH (Loss Of Heterozygosity).

Utrata heterozygotyczności

Utrata heterozygotyczności

W nowotworach dziedzicznych w guzie często

W nowotworach dziedzicznych w guzie często

dochodzi do utraty niezmienionego allela (wild

dochodzi do utraty niezmienionego allela (wild

type allel) genu odpowiedzialnego za chorobę.

type allel) genu odpowiedzialnego za chorobę.

Badanie LOH pozwala zidentyfikować wariant

Badanie LOH pozwala zidentyfikować wariant

markera związany z allelem zmutowanym

markera związany z allelem zmutowanym

Metoda wymaga izolacji DNA pochodzącego z

Metoda wymaga izolacji DNA pochodzącego z

guza.

guza.

Badanie to umożliwia wykluczenie nosicielstwa

Badanie to umożliwia wykluczenie nosicielstwa

mutacji u krewnych osoby chorej .

mutacji u krewnych osoby chorej .

PCR

PCR

(POLYMERASE CHAIN

(POLYMERASE CHAIN

REACTION)

REACTION)

SKŁAD MIESZANINY REAKCYJNEJ:

- matryca DNA
- polimeraza termostabilna
- para specyficznych starterów
(primers)
- trójfosforany deoksyrybonukleotydów
(dNTP)
- bufor (zawierający Mg

2+

)

- H

2

O

ETAPY CYKLU PCR

ETAPY CYKLU PCR

1. DENATURACJA

podwójnej nici DNA - 92-94

o

C

2. PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW

~ 60

o

C

3. ELONGACJA

- 72

o

C

ILOŚĆ KOPII DNA = 2

n

n - ilość cykli

G.K.

Prnciple of a Polymerase Chain Reaction (PCR )

5’

3’

separation of strands

and primer attachment

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

primer elongation

separation of strands

and primer attachment

(1

. cycle)

(2.

cycle etc.)

Primer 1

Primer 2

complementary to primer 2

complementary to primer 1

amplification of target sequence

LONG-RANGE PCR

LONG-RANGE PCR

Amplifikacja do 40 - 50 kpz (w praktyce
do 20 kpz)

W przypadku dużej delecji produkt PCR
jest krótszy o utraconą sekwencję, co
łatwo

zauważyć

podczas

rozdziału

elektroforetycznego

Modyfikacja reakcji PCR polegająca na
zastosowaniu dwóch polimeraz DNA (Taq
i Pwo), buforu o pH zasadowym, niższej
temperatury przyłączania starterów

MLPA

M

ultiplex

L

igation- dependent

P

robe

A

mplification

Ostatnio została opracowana przez zespół badaczy
holenderskich metoda oparta o reakcję ligacji
odpowiednich sond połączoną z reakcją amplifikacji.
Metoda ta pozwala na równoczesną ocenę ilościową
obecności ilości kopii wieloeksonowych genów. Na
podstawie zmian stosunków ilościowych
poszczególnych fragmentów można wnioskować o
delecjach bądź duplikacjach odpowiednich
odcinków genów. Zaletą tej metody jest prostota
wykonania, niska cena i mała ilość DNA potrzebna
do jej wykonania. Coraz większa liczba publikacji
opartych o metodę MLPA świadczy o tym, że może
być ona używana jako rutynowa metoda wykrywania
dużych przemieszczeń.

MLPA

M

ultiplex

L

igation- dependent

P

robe

A

mplification

Ostatnio została opracowana przez zespół badaczy
holenderskich metoda oparta o reakcję ligacji
odpowiednich sond połączoną z reakcją amplifikacji.
Metoda ta pozwala na równoczesną ocenę ilościową
obecności ilości kopii wieloeksonowych genów. Na
podstawie zmian stosunków ilościowych
poszczególnych fragmentów można wnioskować o
delecjach bądź duplikacjach odpowiednich
odcinków genów. Zaletą tej metody jest prostota
wykonania, niska cena i mała ilość DNA potrzebna
do jej wykonania. Coraz większa liczba publikacji
opartych o metodę MLPA świadczy o tym, że może
być ona używana jako rutynowa metoda wykrywania
dużych przemieszczeń.

MAPH ( Multiplex

MAPH ( Multiplex

Amplification and Probe

Amplification and Probe

Hibridization).

Hibridization).

Naniesienie i wiązanie genomowego DNA do

Naniesienie i wiązanie genomowego DNA do

błony.

błony.

Hybrydyzacja DNA z zestawem sond

Hybrydyzacja DNA z zestawem sond

komplementarnych do wykrywanych

komplementarnych do wykrywanych

sekwencji docelowych. Mutacje powodują

sekwencji docelowych. Mutacje powodują

utratę miejsc hybrydyzacyjnycj.

utratę miejsc hybrydyzacyjnycj.

Wypłukiwanie niezwiązanych sond.

Wypłukiwanie niezwiązanych sond.

Zmywanie sond z błony

Zmywanie sond z błony

Jednoczesna amplifikacja do 40 sond z

Jednoczesna amplifikacja do 40 sond z

parami uniwersalnych primerów

parami uniwersalnych primerów

Detekcja -elektroforeza

Detekcja -elektroforeza