TECHNIKI MOLEKULARNE W DIAGNOSTYCE GENETYCZNEJ CHORÓB GENETYCZNYCH

TECHNIKI

MOLEKULARNE

SŁUŻĄCE DO

WYKRYWANIA DUŻYCH

PRZEMIESZCZEŃ

ANALIZY MOLEKULARNE

pozwalają na wykrycie osób

z wysokim ryzykiem

zachorowania na nowotwory

(bezobjawowych

nosicieli

(bezobjawowych

nosicieli

mutacji).

Umożliwia

mutacji).

Umożliwia

skuteczną

tańszą

skuteczną

tańszą

profilaktykę.

MUTACJE

1. SUBSTYTUCJE( tranzycje..,
transwersje.-)

a) „missense” - zmiana aminokwasu

b) „nonsense” - powstanie
przedwczesnego
kodonu stop
c)mutacja milcząca-brak zmiany
aminokwasu

2. DELECJE I INSERCJE

a) z przesunięciem ramki odczytu

b) bez przesunięcia ramki odczytu

3. Inwersje (odwrócenia)

4. Translokacje (przeniesienia)

TYPY MUTACJI ZE

WZGLĘDU

NA ICH WIELKOŚĆ

1. MAŁE MUTACJE

a) substytucje

b) insercje < 100 pz

c) delecje < 100 pz

2. DUŻE MUTACJE (PRZEMIESZCZENIA)

a) delecje (wypadnięcia fragmentu genu) >

100 pz

b) insercje (wstawienia) > 100 pz

c) inwersje (odwrócenia)

d) translokacje (przeniesienia)

TECHNIKI MOLEKULARNE

SŁUŻĄCE DO WYKRYWANIA

DUŻYCH PRZEMIESZCZEŃ

1. SOUTHERN BLOTING
2.

Multipleks PCR z

fluorescencyjnymi

primerami

ANALIZY RNA

4. LOH
5. LONG PCR
6. MLPA
7. MAPH

SOUTHERN BLOTING -

metoda opisana w 1975 r

W  tej  metodzie  genomowe  DNA  poddaje
się  trawieniu  enzymami  restrykcyjnymi,
by  następnie  powstałe    fragmenty,
rozdzielić  elektroforetycznie.  W  celu
uzyskania  formy  jednoniciowej  poddaje
się  je  denaturacji  i  przenosi  na  filtr
nitrocelulozowy bądź nylonowy. Związany
z  filtrem  jednoniciowy  DNA  hybrydyzuje
z sondą (DNA wyznakowany                i
komplementarny do badanego fragmentu
).
W sytuacji gdy występuje  duża mutacja
układ  prążków  jest  odmienny  niż    w
próbkach bez mutacji.

SOUTHERN BLOTING

genomowe DNA

trawienie enzymami restrykcyjnymi

rozdział elektroforetyczny

denaturacja dwuniciowego DNA

transfer na filtr nitrocelulozowy bądź nylonowy

hybrydyzacja jednoniciowego DNA z sondą

analiza autoradiogramu (duża mutacja - układ

prążków

jest odmienny niż w próbkach bez mutacji)

G.K.

Rys.1a Zasada SSCP

Schematic presentation of the blotting procedure

gel containing separated DNA

fragments

gel

membrane

transfer from gel to membrane

identical position of fragments

hybridization with radioactively

labelled DNA

radioautograph of hybrid DNA

DETEKCJA

W wersji z użyciem izotopów obraz

prążków wywołuje się metodą

autoradiografii, przykładając błonę

fotograficzną do filtra w celu

zidentyfikowania pozycji prążków

zajętych przez sondę.

DETEKCJA

Pozycja i intensywność prążków DNA

kontrolnego i zmutowanego różnią się

między sobą .

Duże przemieszczenia DNA

a) (delecje > 100 pz

b) insercje > 100 pz

c) Inwersje

d) translokacje

zmieniają odległości pomiędzy miejscami

restrykcyjnymi, tym samym zmienia się

długość analizowanych fragmentów.

•

Multipleks PCR z fluorescencyjnymi

primerami- kolejną metodą używaną do

wykrywania dużych przemieszczeń.

Metoda Southerna jest czaso- i

pracochłonna.

Wymaga dużych ilości

długocząsteczkowego DNA

Metoda Southerna może być zastąpiona

techniką opartą o

Multipleks PCR z

fluorescencyjnymi primerami

Multipleks PCR z

fluoroscencyjnymi primerami

Równoczesna amplifikacja ilościowa

wielu fragmentów wielu fragmentów

genu badanego i jednego fragmentu

genu odniesienia.

genu odniesienia.
Zmiany stosunków ilościowych
poszczególnych fragmentów
pozwalają wnioskować o delecjach lub
duplikacjach odpowiednich odcinków
genów

Analizy RNA

Multipleks PCR z fluoroscencyjnymi

primerami może być obarczony błędem

wynikającym z różnego stopnia

degradacji próbek DNA. Ilościowe

zmiany mogą mieć charakter

artefaktów.

Brakuje metod służących rutynowemu

wykrywaniu dużych przemieszczeń.

W tym celu pomocne mogą być

badania RNA

Analiza

RNA

Izolacja RNA metodą P.Chomczynskiego: -liza limfocytów

krwi w roztworze rodanku guanidyny (inhibitor RNA-az

ekstrakcja mieszaniną fenolu i chloroformu.

RT/PCR-odwrotna transkrypcja z reakcją PCR

-transkrypcja RNA na komplementarny DNA( RNA po

splicingu<składaniu> pozbawione intronów)

-amplifikacja cDNA przy pomocy reakcji PCR

-Detekcja na żelach agarozowych –wykrycie dużych delecji,

insercji

Test syntezy białka in vitro –IVTT (In Vitro Transcription

Translation Assay)

- RT/PCR

- synteza białka in vitro

- rozdział elektroforetyczny

- przeniesienie na błonę nitrocelulozową i ocena długości

zsyntetyzowanego białka , zmienionej w przypadku

występowania mutacji

WŚRÓD

DZIEDZICZNYCH

PRZYCZYN

NOWOTWORÓW GŁÓWNIE ROZPOZNAWANA

JEST PREDYSPOZYCJA

JEDNOGENOWA

CECHAMI DZIEDZICZENIA

AUTOSOMALNIE

DOMINUJĄCEGO

W tym typie chorób genetycznych

mutacje konstytucyjne

(tj. obecne we

wszystkich komórkach organizmu)

pojedynczym genie są główną

przyczyną zachorowania.

We wszystkich nowotworach występują

mutacje genów, są to jednak tzw.

mutacje somatyczne

występujące

jedynie w tkance nowotworowej.

LOH (Loss Of Heterozygosity).

Utrata heterozygotyczności

W nowotworach dziedzicznych w guzie często

dochodzi do utraty niezmienionego allela (wild

type allel) genu odpowiedzialnego za chorobę.

Badanie LOH pozwala zidentyfikować wariant

markera związany z allelem zmutowanym

Metoda wymaga izolacji DNA pochodzącego z

guza.

Badanie to umożliwia wykluczenie nosicielstwa

mutacji u krewnych osoby chorej .

PCR

(POLYMERASE CHAIN

REACTION)

SKŁAD MIESZANINY REAKCYJNEJ:

- matryca DNA
- polimeraza termostabilna
- para specyficznych starterów
(primers)
- trójfosforany deoksyrybonukleotydów
(dNTP)
- bufor (zawierający Mg

)

- H

ETAPY CYKLU PCR

1. DENATURACJA

podwójnej nici DNA - 92-94

2. PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW

~ 60

3. ELONGACJA

- 72

ILOŚĆ KOPII DNA = 2

n - ilość cykli

G.K.

Prnciple of a Polymerase Chain Reaction (PCR )

5’

3’

separation of strands

and primer attachment

5’

3’

5’

3’

5’

primer elongation

separation of strands

and primer attachment

. cycle)

(2.

cycle etc.)

Primer 1

Primer 2

complementary to primer 2

complementary to primer 1

amplification of target sequence

LONG-RANGE PCR

Amplifikacja do 40 - 50 kpz (w praktyce
do 20 kpz)

W przypadku dużej delecji produkt PCR
jest krótszy o utraconą sekwencję, co
łatwo

zauważyć

podczas

rozdziału

elektroforetycznego

Modyfikacja reakcji PCR polegająca na
zastosowaniu dwóch polimeraz DNA (Taq
i Pwo), buforu o pH zasadowym, niższej
temperatury przyłączania starterów

MLPA

ultiplex

igation- dependent

robe

mplification

Ostatnio została opracowana przez zespół badaczy
holenderskich metoda oparta o reakcję ligacji
odpowiednich sond połączoną z reakcją amplifikacji.
Metoda ta pozwala na równoczesną ocenę ilościową
obecności ilości kopii wieloeksonowych genów. Na
podstawie zmian stosunków ilościowych
poszczególnych fragmentów można wnioskować o
delecjach bądź duplikacjach odpowiednich
odcinków genów. Zaletą tej metody jest prostota
wykonania, niska cena i mała ilość DNA potrzebna
do jej wykonania. Coraz większa liczba publikacji
opartych o metodę MLPA świadczy o tym, że może
być ona używana jako rutynowa metoda wykrywania
dużych przemieszczeń.

MLPA

ultiplex

igation- dependent

robe

mplification

MAPH ( Multiplex

Amplification and Probe

Hibridization).

Naniesienie i wiązanie genomowego DNA do

błony.

Hybrydyzacja DNA z zestawem sond

komplementarnych do wykrywanych

sekwencji docelowych. Mutacje powodują

utratę miejsc hybrydyzacyjnycj.

Wypłukiwanie niezwiązanych sond.

Zmywanie sond z błony

Jednoczesna amplifikacja do 40 sond z

parami uniwersalnych primerów

Detekcja -elektroforeza

Document Outline