Ekstrakcja do fazy stałej (SPE)

Solid Phase Extraction - SPE



Wprowadzona w latach 70-dziesiatych



Wydajna i szybka metoda selektywnego
izolowania, a także zagęszczania i
oczyszczania od matrycy biologicznej
lub środowiskowej



Umożliwia przygotowanie prób o
odpowiedniej czystości do analizy HPLC,
GC, HPTLC, RIA, spektrofotometrycznej
itp..

Solid Phase Extraction - SPE



Polega na przeniesieniu analitów, dzięki
wykorzystaniu zjawiska podziału, z próbki
ciekłej do fazy stałej, którą stanowią
sorbenty



Stosuje się obniżone ciśnienie w celu elucji
małych porcji rozpuszczalników



Zaczyna z powodzeniem zastępować
ekstrakcję ciecz-ciecz, ponieważ
pozbawiona jest większości jej wad

SPE - zalety



Możliwość izolacji i wzbogacania
zarówno analitów lotnych, jak i
nielotnych



Możliwość zastosowania zarówno do
ekstrakcji składników organicznych, jak
i nieorganicznych, np. metali



Możliwość przechowywania analitów
zatrzymanych w warstwie sorbentu
przez długi czas

SPE - zalety



Drastyczne zmniejszenie ilości używanych
rozpuszczalników



Wyeliminowanie problemów związanych z
tworzeniem się emulsji w procesie
ekstrakcji (ciecz-ciecz), czy tez pienienia
się próbki (ciecz-gaz)



Możliwość wykorzystania nie tylko w
procesie izolacji i wzbogacania, ale także w
trakcie oczyszczania i frakcjonowania
ekstraktów

SPE - zalety



Duży wybór stałych sorbentów
umożliwia uzyskanie znacznej
selektywności procesu wzbogacania, co
poważnie zmniejsza ryzyko interferencji
na dalszych etapach procesu
analitycznego



Wysoka powtarzalność procesu



Łatwość automatyzacji procesu

Wypełnienia kolumn SPE

Wypełnienie

Struktura związanego ligandu

Odwrócone fazy

Octadecyl (C18)

-(CH2)17-CH3

Octyl (C8)

-(CH2)7-CH3

Ethyl (C2)

-CH2-CH3

Cyklohexyl

-CH2-CH2-

Phenyl

-CH2CH2CH2-

Normalne fazy

Cjano (CN)

-(CH2)3CH

Amino (NH2)

-(CH2)NH2

Diol (COHCOH)

-(CH2)3-OCH2CH-CH2OH OH

Adsorpcyjne

Żel krzemionkowy

-SiOH

Florisil ®

Mg2SiO3

Tlenek glinu

Al2O3

Wypełnienia kolumn SPE

Wypełnienie

Struktura związanego ligandu

Jonowymienne

Amino (NH2)

-(CH2)3 NH2

1,2 – Amino (NH/NH2)

-(CH2)3 NH CH2CH2 NH3

Amina IV-rzedowa (N+)

-(CH2)2 COOH

Kwas karboksylowy (COOH)

-(CH2)3 N+ (CH3)2

Kwas (SO2 OH)

-(CH2)3 SO2 OH

Kwas (Ar SO2 OH)

-(CH2) -3- SO2 OH

SE
Sephadex® G-25

Dextran

Szerokoporowate

RP Butyl (C4)

-(CH2)3 CH3

HI HI-propyl (C3)

-(CH2)2 CH3

IE CBX (kwas karboksylowy)

-COOH

PEI (polietylenoimina)

-(CH2CH2NH)n-

Wypełnienia kolumn SPE

Dobór fazy stałej i eluentu zależny jest

od rozpuszczalności, polarności,

właściwości chemicznych izolowanych

analitów, ich ilości, objętości próbki,

stopnia zanieczyszczenia, złożoności

matrycy, a także wpływu matrycy lub

innych analitów.

SPE – zastosowanie



SPE stosowana jest do prób osocza,
surowicy, śliny, potu, włosów



Stosowanie jej do prób krwi pełnej,
tkanek i narządów musi być
poprzedzone izolowaniem wstępnym



W zależności od rodzaju badanego
materiału, należy usunąć białka, lipidy i
inne ciała balastowe. Niekiedy należy
dodatkowo wykonać hydrolizę

Odbiałczanie



Można stosować rożne substancje: kwas
wolframowy, nadchlorowy,
trichlorooctowy, alkohol etylowy,
mieszaninę alkoholu etylowego i kwasu
winowego, siarczan amonowy, czy
alkaliczny r-r siarczanu cynku



Proces prowadzi się w temp 60-100 ºC, co
jest czynnikiem przyśpieszającym, a także
zwiększa rozpuszczalność w wodzie
związków trudno rozpuszczalnych

Odbiałczanie

Najczęściej stosuje się metody:



Siarczanowo-amonową



Wolframową

Metoda wolframowa nadaje się
szczególnie do materiału biologicznego
zawierającego trucizny o charakterze
kwaśnym i obojętnym. Mniej przydatna
dla związków zasadowych.

Metoda siarczanowo-

amonowa

Do 50 g próbki dodaje się siarczan
amonowy i 1M kwas siarkowy do pH 4.
Mieszaninę ogrzewa się do wrzenia i w
tej temperaturze utrzymuje się przez 3
minuty, po czym sączy się na gorąco, a
osad na sączku przemywa wrząca
woda, aż do uzyskania 500ml
przesączu.

Metoda wolframowa

1cz. materiału homogenizuje się z 1cz.
25% r-r wolframianu sodowego i 1cz.
wody. Mieszaninę przenosi się do kolby,
homogenizator przepłukuje 4cz. wody. Po
podaniu 1cz. 50% r-r disiarczanu
sodowego, mieszaninę ogrzewa się na
łaźni wodnej, aż przestanie ciemnieć,
sączy się lub wiruje. Przesącz ekstrahuje
rozp. organicznymi tj.: chloroform, eter,
octan etylu.

SPE – tok postępowania



Kondycjonowanie kolumienek



Podanie próbki



Przemywanie



Elucja

SPE – kondycjonowanie

kolumn

Proces polega na aktywacji

materiału wypełniającego

przed naniesieniem próbek.

Rodzaj rozpuszczalnika zależy

od materiału wypełniającego

kolumienkę i rodzaju

analizowanego związku.

SPE – podanie próbki

(adsorpcja)

Objętość próbki: od kilku

mikronów do litrów. Dla

maksymalnej wydolności

systemu nie powinna
przekraczać 250ml w

odwróconym układzie

polarności. Szybkość

prowadzenia procesu jest

czynnikiem decydującym o

retencji wielu składników.

SPE - przemywanie

W celu oczyszczenia

pozostających w materiale

wypełniającym kolumienkę –

przemyć roztworem, w którym

próbka była rozpuszczona, lub

innym, nie wypłukującym

interesujących nas związków.

SPE - elucja

Przemycie kolumienek małymi

porcjami (200mcl do 2ml) r-rów

mających zdolność wyrugowania

oznaczanych związków.

Większa wydajność procesu

zachodzi przy stosowaniu

mniejszych objętości eluentu.

Rzadziej: ekstrakcja nadkrytyczna,

czy desorpcja termiczna.

Użycie dwóch lub

więcej kolumienek z

rożnymi adsorbentami

umożliwia wstępne

rozdzielenie analitu na

grupy związków, co

podnosi czułość i

selektywność metody.

SPE – ograniczenia/wady

Rurki sorpcyjne i kolumienki ekstrakcyjne:



Stosunkowo łatwo następuje
mechaniczne zatkanie porów materiału
adsorbującego, zwłaszcza jeśli próbka
nie była uprzednio filtrowana



Strumień próbki można przepuszczając
przez złoże sorbentu w ograniczonym
zakresie natężeń przepływu, co może
istotnie przedłużyć czas ekstrakcji

SPE – zalety krążków

ekstrakcyjnych



Przyspieszenie wzbogacania dzięki
możliwości zwiększania przepływu
przez urządzenie ekstrakcyjne



Brak efektu ‘kanalikowania’ złoża



Mała objętość martwa



Łatwość suszenia krążka przed elucją
zatrzymanych analitów

Jednym z kierunków badan mających

doprowadzić do wytworzenia tzw.

szybkich krążków ekstrakcyjnych, które

mogą znacznie skrócić czas ekstrakcji,

są prace nad wykorzystaniem krążków

na matrycy z włókna szklanego.

Document Outline