Najczęstsze techniki

molekularne stosowane

w laboratorium

klinicznym

Analiza DNA



Izolacja materiału genetycznego



Elektroforeza



Amplifikacja



Analiza Restrykcyjna



Sekwencjonowanie



itd

W badaniach molekularnych stosuje

się DNA (RNA) pozyskane z krwi

obwodowej, komórek naskórka,

komórek pozyskanych z płynu

owodniowego, kosmówki, włosów,

nasienia….

W przypadku badań nowotworów

stosuje się komórki uzyskane z

biopsji tkanki nowotworowej.

Jakość wyniku zależy od jakości

materiału genetycznego użytego do

badania.

Materiał genetyczny zdegradowany i

zanieczyszczony nie nadaje się do

dalszej analizy (brak wyniku).

Najwygodniejszym materiałem

wyjściowym do dalszej analizy

molekularnej jest krew obwodowa.

Do wykonania pełnych badań

diagnostycznych wystarczy 1ml

pobranej na EDTA.

Inne antykoagulanty mogą być

stosowane pod warunkiem że nie

interferują podczas dalszych prac z

materiałem genetycznym.

(heparyna inhibuje niektóre enzymy

restykcyjne)

Izolacja



Uzyskanie z maksymalną

wydajnością wysokocząsteczkowego

materialu genetycznego, przy

jednoczesnym pozbawieniu

preparatu zanieczyszczeń

Etapy izolacji

Dezintegracja tkanek i rozbicie błon

komórkowych.

•

Homogenizacja

•

Trawienie tkanek trypsyną

•

Bufory lizujące

•

Proteinaza K

•

SDS

•

Triton X / igepal

•

Mocznik

Oczyszczenie preparatu z

białek

•

Fenol - chloroform

•

Wysalanie 5 M NaCl

•

Związanie DNA z nośnikiem i

wypłukanie zanieczyszczeń

Pozyskiwanie DNA



Ekstrakcja alkoholem 99.8%



Ekstrakcja octanem amonu i

izopropanolem

Ocena jakościowa i

ilościowa

Stosunek absorbancji fal o długości

260 nm do 280 nm jest miarą

czystości uzyskanego roztworu DNA

(A260/A280 ). Wartość współczynnika

A260/A280 mieszcząca się w

przedziale 1,7 - 2,0 świadczy o

prawidłowej czystości roztworu DNA

Stężenie dsDNA

C(µg/ml) = (A260-A320) x 50 x R (rozcieńczenie)

Stężenie ssDNA

C(µg/ml) = (A260-A320) x 33 x R (rozcieńczenie)

Stężenie RNA

C(µg/ml) = (A260-A320) x 44 x R (rozcieńczenie)



Elektroforeza w żelu agarozowym

(0.8%) w obecności bromku etydyny

(0.5



Porównanie intensywności świecenia

badanej próby z próbkami o znanym

steżeniu – ocena ilościowa



Porównanie do wzorca wielkości KBL-

>50kpz DNA wysokoczasteczkowe

Elektroforeza

Elektroforeza jest zjawiskiem elektrokinetycznym,

w którym pod wpływem przyłożonego pola

elektrycznego przemieszczają się

makrocząsteczki obdarzone niezrównoważonym

ładunkiem elektrycznym. Prędkość

przemieszczania się naładowanej elektrycznie

makrocząsteczki zależy od jej ładunku, rozmiaru,

kształtu oraz oporów ruchu środowiska.

Wykorzystując te zależności można dokonać

szybkiej separacji różnych makrocząsteczek przy

zastosowaniu stosunkowo prostych urządzeń i

przy relatywnie niskim nakładzie kosztów.

Technika stosowana przy rozdziale ,

analizie i oczyszczaniu kwasów

nukleinowych i białek.

DNA i RNA mają ładunek ujemny i zgodnie

z tym ładunkiem , nadawanym przez grupy

fosforanowe , migrują w polu elektrycznym

w kierunku anody. Szybkość migracji

zależy od wielkości i kształtu cząsteczki

(odwrotnie proporcjonalna do log

pz)

Żele agarozowe

Metoda szybka, prosta, powszechnie

stosowana. Zdolność rozdzielcza zależy od

wielkości porów w żelu , których rozmiary

są zdeterminowane przez stężenie

agarozy.



1,4-2,0 % używa się do rozdziału

cząsteczek mniejszych (0,5-2,0 kb).



0,5-0,7 % stosuje się do rozdziału

cząsteczek większych (10-20 kb i więcej).

Żele akrylamidowe

Powstają przez polimeryzacje monomerów

akrylamidu w długie łańcuchy z

wytworzeniem wiązań poprzecznych przez

bisakrylamid.

bisakrylamid.
Gęstość sieciowania oraz rozmiary porów

można regulować poprzez odpowiedni

dobór stężenia akrylamidu i bisakrylamidu

T [%] =((AA + bis-AA)[g]/ obj.[ml])x 100

Dopełniającym parametrem jest wagowy

stosunek ilości substancji sieciującej do

sumyakrylamidu i substancji sieciującej:
C [%] = (bis-AA [g] / (AA + bis-AA) [g]) x 100
Ze wzrostem wartości T maleje średni

rozmiar porów. Natomiast minimalny rozmiar

porów, przy zadanej wartości T, uzyskuje się

dla wartości C = 5%. Powyżej i poniżej tej

wartości rozmiary porów wzrastają.

Akrylamid w postaci monomerycznej
jest bardzo silną neurotoksyną i
nawet po procesie polimeryzacji
stanowi poważne zagrożenie dla
zdrowia ze względu na pozostałości
swobodnych monomerów w objętości
żelu.

Wolnorodnikową reakcje
polimeryzacji, można zainicjować
chemicznie lub fotochemicznie. Przy
chemicznej inicjacji procesu
najczęściej stosuje się nadsiarczan
amonu (APS) lub nadsiarczan potasu
(PERS) w obecności katalizatora
N,N,N.,N.-tetrametyletylenodiaminy
(TEMED).

Fotochemiczne wyzwolenie procesu
polimeryzacji zachodzi w obecności
ryboflawiny pod działaniem
długofalowego światła UV i jest
katalizowane przez TEMED.

Żele denaturujące

Szybkość migracji w żelu jednoniciowych

cząsteczek , zależy nie tylko od ich

wielkości i ładunku ale także w dużym

stopniu od ich struktury przestrzennej (w

przypadku dwuniciowych cząsteczek DNA

nie ma to większego znaczenia) aby

dokładnie określić ich wielkość należy

wyeliminować różnice w szybkości migracji

wywołane różną konformacją cząsteczki.

Jest to szczególnie ważne w przypadku

jednoniciowego RNA , które tworzy

miejscowe struktury dwuniciowe.

Najczęściej używanymi czynnikami

denaturującymi są : formaldehyd i

glioksal w żelach agarozowych (przy

analizie preparatów RNA) lub

mocznik w żelach

poliakrylamidowych (przy analizie

jednoniciowych fragmentów DNA).

Ze względu na sposób umieszczenia
nośnika elektroforetycznego można
wyróżnić elektroforezę kapilarną
(ang. capillary electrophoresis),
elektroforezę pionową (ang. Vertical
electrophoresis) oraz elektroforezę
poziomą (ang. horizontal
electrophoresis).

W elektroforezie kapilarnej- HPCE (ang. high

performance capillary electrophoresis) elektrolit

wypełnia kapilaręo wewnętrznej średnicy 50 -

100 μm i długości 20-30 cm. Oba końce kapilary

zanurzone są w zasobnikach z odpowiednimi

elektrolitami. Sama kapilara wypełniona jest

swobodnym elektrolitem (elektroforeza

swobodna) lub porowatym nośnikiem

(elektroforeza na nośniku). Do obu końców

kapilary przykłada się wysokie napięcie co

skutkuje pojawieniem się we wnętrzu kapilary

pola elektrycznego o wartości natężenia około

1kV/cm i prądu rzędu 10 mA.

Przeznaczeniem elektroforezy kapilarnej są

rozdziały analityczne i mikropreparatywne. Ilość

nanoszonego materiału do analizy jest bardzo

niewielka - rzędu pojedynczych nanogramów.

Objętość aplikowanej próbki waha się zwykle w

przedziale 2-4 nl (2-4x10-9 l). Czas rozdziału

jednej próbki wynosi około 10-20 minut. Detekcja

rozdzielonych grup makrocząsteczek realizowana

jest u ujścia kapilary przy pomocy detektora o

konstrukcji zbliżonej do przepływowego detektora

stosowanego w chromatografii cieczowej.

Elektroforeza pionowa - jest
najpowszechniej stosowną techniką.
W technice tej nośnik
elektroforetyczny wypełnia szklane
rurki (elektroforeza rurkowa) lub
znajduje się pomiędzy dwoma
płytkami rozdzielonymi przekładkami
dystansowymi (ang. Spacer-
elektroforeza płytowa).

Elektroforeza pozioma - jest rodzajem

elektroforezy w którym nośnik umieszczony jest w

płaszczyźnie poziomej. Zaletą tego rozwiązania

jest brak wycieków elektrolitu oraz możliwość

łatwego odprowadzenia ciepła generowanego w

trakcie przepływu prądu.
Elektroforeza półsucha, w której bufory

elektrodowe zamknięte są w zestalonej agarozie

lub w warstwach bibuły filtracyjnej, pozwala

ponadto na znaczne ograniczenie zużycia

chemikaliów niezbędnych do przygotowania

buforów.

Elektroforeza w polu

pulsacyjnym

Stosowana do rozdzielenia dużych cząsteczek

DNA - od 20 kb do 10 Mb. Można w ten sposób

rozdzielić całe chromosomy np. drożdżowe. Pole

elektryczne jest włączane i wyłączane w krótkich

odstępach czasu. Kiedy pole elektryczne jest

włączone cząsteczki migrują zgodnie ze swoją

wielkością a gdy zostaje wyłączone mają

tendencję do relaksacji i zwijania w przypadkowe

pętle. Czas wymagany do relaksacji jest wprost

proporcjonalny do długości cząsteczki. Następnie

kierunek pola elektrycznego jest zmieniany o 90

lub 180 stopni w stosunku do poprzedniego.

Dłuższe cząsteczki zaczynają poruszać się wolniej

niż krótsze. Powtarzające się zmiany kierunku

pola stopniowo powodują rozdzielenie.

Detekcja



Barwniki inerkalujące (EtBr)



Barwienie srebrem



Autoradiografia



Detekcja laserowa



Immunoznakowanie

PCR

PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy (ang.

polymerase chain reaction) polega na

przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA z

wykorzystaniem starterów flankujących

określony odcinek DNA o długości od

kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów. Jest to

metoda alternatywna do klonowania i może

być używana w celu amplifikacji nawet

bardzo rzadkich sekwencji w mieszaninie

ale warunkiem jest znajomość sekwencji

otaczającej powielany fragment. W praktyce

wystarczy tylko jedna cząsteczka matrycy.

DNA jest denaturowany termicznie w

temperaturze około 90°C.

Syntetyczne oligonukleotydy długości

mniej więcej 20 nukleotydów

komplementarne do 3` końców

kawałka DNA , którego powieleniem

jesteśmy zainteresowani , dodane są

w dużym nadmiarze molowym do

zdenaturowanego DNA.

Temperatura zostaje obniżona do 40-60°C.

DNA pozostaje zdenaturowany ponieważ

komplementarne łańcuchy są w zbyt

niskiej koncentracji , w porównaniu z

ilością starterów , aby zrenaturować.

Specyficzne oligonukleotydy hybrydyzują z

komplementarnymi sekwencjami w DNA

(tzw. annealing) i służą jako startery do

syntezy DNA , którą prowadzi

termostabilna DNA polimeraza tzw.

Taq

polimeraza izolowana z bakterii

Thermus

aqaticus

RT-PCR (reverse transcriptase PCR)
Matrycą wyjściową jest RNA, które w
procesie odwrotnej transkrypcji jest
przepisywane na komplementarne
DNA (ang. Complementary DNA,
cDNA). Następnie cDNA ulega
amplifikacji, jak w zwykłym PCR.

nested-PCR
Stosowane są 2 pary starterów:
zewnętrzna (komplementarna do końców
poszukiwanej sekwencji) i wewnętrzna
(przyłącza się przyśrodkowo w stosunku do
pierwszej pary starterów). Produkt
powstały po amplifikacji z pierwszą parą
poddaje się kolejnej rundzie z 2 parą.
Zapewnia to większą specyficzność
metody.

RAPD (random amplified polymorphic
DNA)
Metoda wykorzystywana, gdy nieznane są
sekwencje specyficzne, stosuje się krótkie
uniwersalne startery(10nt), którymi
amplifikuje się zbiór produktów, a ich
liczba i długości są zależne od sekwencji
nukleotydowej matrycy oraz warunków
reakcji.

Do każdej reakcji dodawany jest jeden

rodzaj startera. Zakłada się występowanie

sekwencji typu odwróconych powtórzeń w

takiej odległości od siebie w genomie ,

która pozwoli na wydajną amplifikację czyli

300 do 1500 par zasad. Elektroforetyczny

obraz prążków jest charakterystyczny dla

osobnika. Zastosowanie; określanie

stopnia pokrewieństwa między

organizmami a także m.in. w

kryminalistyce w celach identyfikacji.

multiplex-PCR
Równoczesne zastosowanie kilku par
starterów w mieszaninie reakcyjnej
umożliwia diagnozowanie kilku
patogenów jednocześnie. Produkty
muszą się różnić długością.

PCR

in situ

- nowa technika

pozwalająca na przeprowadzenie

reakcji w tkance bez naruszania jej

struktury np. na preparacie

mikroskopowym.

PCR-RFLP-połączenie PCR z analizą
restrykcyjną. Produkty amplifikacji
poddaje się działaniu restryktazy (1
lub więcej) i porównuje wzór
powstałych prążków.

Real-time PCR (PCR w czasie

rzeczywistym)- metoda ilościowa

pozwalająca na obserwowanie

amplifikacji w czasie rzeczywistym.

Wraz z przybywaniem produktów PCR

wzrasta intensywność fluorescencji

rejestrowanej przez detektor.

Odzwierciedlone jest to w postaci

wykresu na monitorze komputera.

Sekwencjonowanie

Metoda, dzięki której możliwe jest

ustalenie sekwencji czyli określenie

kolejności nukleotydów. Jeden z

etapów analizy genu. Na podstawie

sekwencji istnieje możliwość

przewidzenia kolejności

aminokwasów w białku , które jest

kodowane przez dany gen.

Chemiczna - metoda

Maxama-Gilberta

Polega na degradacji wyznakowanych na 5`

końcu cząsteczek DNA związkami chemicznymi

przecinającymi specyficznie wiązania

fosfodiestrowe za nukleotydem odpowiadającym

określonej zasadzie azotowej. Wynikiem reakcji

jest zbiór fragmentów DNA o różnej długości co

spowodowane jest takim doborem warunków , że

w poszczególnych cząsteczkach przecinane jest

tylko jedno lub dwa wiązania. Fragmenty z

czterech niezależnych reakcji (dGTP , dGTP i

dATP , dCTP , dCTP i dTTP) rozdziela się

elektroforetycznie po czym poddaje

autoradiografii. Prążki na autoradiogramie

odpowiadają fragmentom DNA posiadającym na

końcu 5` znakowany fosfor a na końcu 3`

określoną zasadę.

Enzymatyczna - metoda

Sangera

Na jednoniciowej matrycy syntetyzuje się

in vitro

DNA. Synteza przebiega od radioaktywnego ,

oligonukleotydowego startera komplementarnego

do 3` końca matrycy. Reakcję wykonuje się

równolegle w czterech probówkach , w których

oprócz kompletu deoksytrifosforanów

nukleotydów (dATP , dCTP , dTTP , dGTP) dodana

jest niewielka ilość jednego z nich w postaci

dideoksytrifosforanu nukleotydu , co uniemożliwia

kontynuowanie reakcji w momencie włączenia

takiego nukleotydu w syntetyzowany łańcuch ,

ponieważ brakuje wtedy grupy hydroksylowej na

3` końcu.

Obecnie coraz częściej znakowanie przy

użyciu radioizotopów zostaje zastąpione

przez wykorzystanie znaczników

fluorescencyjnych.

Znaczniki te mogą podobnie jak izotopy

występować na ddNTP lub starterach. W

przypadku zastosowania tego wariantu

dalsze etapy procedury są identyczne, jak

w klasycznej metodzie dideoksy. Pojawia

się tu jednak pewna znacząca różnica, a

mianowicie w przypadku użycia starterów

różnobarwnych, podczas elektroforezy

korzysta się tylko z jednej ścieżki.

Wykrywanie mutacji

Bezpośrednie wykrywanie mutacji
jest najbardziej swoistą metodą
wykrywania zaburzeń w obrębie
genu. Umożliwia rozpoznanie
nosicielstwa mutacji niemal ze 100%
pewnością.

Pośrednie wykrywanie mutacji jest
metodą o nieco mniejszej swoistości
pozwala natomiast na potwierdzenie
lub wykluczenie nosicielstwa mutacji
w wielu przypadkach, w których nie
można wykryć zmian bezpośrednio w
genach.

Wykrywanie mutacji

nieznanych

SSCP - badanie zmian konformacji

jednoniciowego DNA
Jednoniciowe DNA w roztworze wykazuje

określoną strukturę drugorzędową.

Struktura ta zależy od rodzaju i sekwencji

zasad tworzących nić DNA. Mutacje

punktowe, delecje i insercje powodują

zmiany struktury drugorzędowej, która

wpływa na szybkość poruszania się nici w

trakcie elektroforezy na niedenaturujących

żelach poliakrylamidowych. Nici normalne i

zmutowane wykazują odmienną ruchliwość

elekroforetyczną

Niedogodności SSCP to przede wszystkim

konieczność analizowania produktów PCR

nie dłuższych niż 200-300 pz (par zasad),

bowiem przy większej długości produktów

spada znacząco czułość wykrywania

mutacji. Dlatego by ocenić sekwencję

kodującą dużych genów trzeba wykonać

wiele reakcji PCR, np. gen BRCA1 należy

analizować poprzez badanie 40 różnych

produktów amplifikacji.
Czułość SSCP w wykrywaniu mutacji nie

przekracza 80%

HET - analiza

heterodupleksów

Sekwencje niezmienione oraz sekwencje z
mutacją są obecne w reakcji PCR (jako
matryce)
Produktami tej reakcji są cztery różne
dwuniciowe fragmenty DNA.
Dwa homodupleksy (struktury dwuniciowe
w pełni komplementarne). Dwa inne to
heterodupleksy zawierające miejsca
niesparowane (mismatch).

Heterodupleksy ze zmianą co
najmniej jednej zasady mogą
wykazywać inną w porównaniu do
homodupleksów ruchliwość podczas
elektroforezy na zwykłym
poliakrylamidowym żelu.
Czułość 90%

CMC - chemiczne rozszczepianie

niesparowań heterodupleksów

Niesparowane w heterodupleksach zasady
C i T ulegają chemicznej modyfikacji,
odpowiednio z hydroksyloaminą i
czterotlenkiem osmu. Miejsca wiązania
tych substancji są cięte z użyciem
piperydny. Pocięte fragmenty DNA są
rozdzielane elektroforetycznie.

Wykrywanie mutacji w odcinkach DNA

długości 1-2 kpz.