OGÓLNE ZASADY

DIAGNOSTYKI

MIKROBIOLOGICZNEJ

Katedra i Zakład Mikrobiologii

Lekarskiej

Anna Majewska

DROBNOUSTROJE

•BAKTERIE

•WIRUSY

•GRZYBY

RODZAJE INTERAKCJI

DROBNOUSTROJU Z ORGANIZMEM

DROBNOUSTROJE

KOMENSALNE

DROBNOUSTROJE
OPORTUNISTYCZNE

DROBNOUSTROJE PATOGENNE

DIAGNOSTYKA
MIKROBIOLOGICZNA

CEL:

• IDENTYFIKACJA CZYNNIKA
ETIOLOGICZNEGO
ODPOWIEDZIALNEGO
ZA ZAKAŻENIE

• OKREŚLENIE JEGO PROFILU
WRAŻLIWOŚCI NA
CHEMIOTERAPEUTYKI

• NADZÓR MIKROBIOLOGICZNY I
EPIDEMIOLOGICZNY

POBRANIE MATERIAŁU

TRANSPORT

METODA
DIAGNOSTYCZNA

PRÓBKI MATERIAŁU DO BADANIA

MIKROBIOLOGICZNEGO

WYMAZ Z GARDŁA I MIGAŁKÓW,

PLWOCINA,

WYMAZ Z RANY, ROPA Z ROPNIA,

WYCINKI TKANEK,

KREW, KAŁ, MOCZ,

POPŁUCZYNY PĘCHERZYKOWO-
OSKRZELOWE

PŁYN MÓZGOWO-RDZENIOWY,

WYMAZ ZE SPOJÓWKI,

ZESKROBINY ROGÓWKOWE

ZASADY

•PRZED ROZPOCZĘCIEM CHEMIOTERAPII

•Z MIEJSC, W KTÓRYCH TOCZY SIĘ PROCES

CHOROBOWY

•W ODPOWIEDNIM CZASIE

•POBRAĆ ODPOWIEDNIĄ ILOŚĆ/OBJĘTOŚĆ

MATERIAŁU

•ZACHOWAĆ ZASADY ASEPTYKI (SPRZĘT,

DEZYNFEKCJA SKÓRY)

•ZAPEWNIĆ WŁAŚCIWE WARUNKI
PRZECHOWYWANIA I TRANSPORTU

(TERMICZNE, PODŁOŻA
TRANSPORTOWE)

•DOSTARCZYĆ DO PRACOWNI
MIKROBIOLOGICZNEJ

W MOŻLIWIE

NAJKRÓTSZYM CZASIE

METODY

BEZPOŚREDNIE

BEZPOŚREDNIE

POŚREDNIE

POŚREDNIE

WYKRYCIE DROBNOUSTROJU WYKRYCIE
SWOISTYCH
LUB JEGO FRAGMENTU
PRZECIWCIAŁ
W MATERIALE KLINICZNYM

METODY

METODY NIEHODOWLANE

METODY NIEHODOWLANE

(SZYBKIE

(SZYBKIE

TESTY

TESTY

DIAGNOSTYCZNE)

DIAGNOSTYCZNE)

METODY KONWENCJINALNE

(HODOWLA DROBNOUSTROJÓW)

METODY HODOWLI DROBNOUSTROJÓW
POŁĄCZONE Z IZOLACJĄ I
IDENTYFIKACJĄ MIKROORGANIZMU
(NAJCZĘŚCIEJ DO GATUNKU) NAZYWANE
SĄ METODAMI KONWENCJONALNYMI
(KLASYCZNYMI).

SĄ SZCZEGÓLNIE ISTOTNE W
BAKTERIOLOGII I MIKOLOGII, GDZIE
OPRÓCZ IDENTYFIKACJI CZYNNIKA
ETIOLOGICZNEGO POWINNY BYĆ
WYKONANE TESTY WRAŻLIWOŚCI NA
CHEMIOTERAPEUTYKI/ANTYBIOTYKI.

METODY

METODY

KONWENCJONALNE

KONWENCJONALNE

(HODOWLA)

(HODOWLA)

IZOLACJA I IDENTYFIKACJA

DROBNOUSTROJU

W POBRANYCH MATERIAŁACH
WYSTĘPUJĄ RÓŻNE GATUNKI
DROBNOUSTROJÓW, W CELU ICH
WYIZOLOWANIA, NAMNOŻENIA I
UZYSKANIA CZYSTEJ HODOWLI, PRÓBKI
POSIEWA SIĘ NA ODPOWIEDNIE
PODŁOŻA WZROSTOWE.

HODOWLA DROBNOUSTROJÓW

STWORZYĆ WARUNKI W KTÓRYCH BYTUJĄ

DROBNOUSTROJE

W A R U N K I H O D O W L I:

TLENOWE, MIKROAEROFILNE

,

BEZTLENOWE

TEMPERATURA: 35-37°C, 22-30°C

CIŚNIENIE OSMOTYCZNE - IZOTONICZNE

STĘŻENIE JONÓW WODOROWYCH (pH) - 6,8 - 7,5

P O D Ł O Ż A (POŻYWKI) H O D O W L A
N E

PŁYNNE, PÓŁPŁYNNE, STAŁE

PROSTE, WZBOGACONE, SPECJALNE ,
RÓŻNICUJĄCE,

WYBIÓRCZE, WYBIÓRCZO - RÓŻNICUJĄCE

IDENTYFIKACJA

•NA PODSTAWIE
CHARAKTERYSTYCZNEGO

WZROSTU

NA PODŁOŻACH

(MORFOLOGII

KOLONII)

S. aureus

Salmonella spp.

MORFOLOGIA KOLONII

•KSZTAŁT

-

OKRGŁY, OWALNY, SOCZEWKOWATY,

PROMIENISTY

•

WIELKOŚĆ

-

ŚREDNICA KOLONII [W MM]

•

BRZEG

-

RÓWNY, FALISTY, POSZARPANY

•

POWIERZCHNIA

-

GŁADKA, POMARSZCZONA,

GRUBOZIARNISTA

•

WYNIOSŁOŚĆ PONAD POWIERZCHNIĘ

-

PŁASKA,

BRAK,

STOŻKOWATA

•

KOLOR

-

KOLONII, PODOŻA

• PRZEJRZYSTOŚĆ

-

PRZEJRZYSTA, MĘTNA

• ZAPACH

-

DROŻDŻY, MIODU

•

TYP HEMOLIZY

-

α, β, γ

PRODUKCJA

HEMOLIZYN

S. pyogenes

S. pneumoniae

C. perfringens - podwójna hemoliza

WZROST NA PODŁOŻACH
PŁYNNYCH

WZROST DROBNOUSTROJÓW ZWIĄZANY
JEST ZE SPOSOBEM ODDYCHANIA
BAKTERII.

• MOŻE ODBYWAĆ SIĘ

NA POWIERZCHNI

POŻYWKI,

• TWORZYĆ

OSAD

NA DNIE NACZYNIA LUB

POWODOWAĆ

• ZMĘTNIENIE

CAŁEJ POŻYWKI

•

NA PODSTAWIE WYNIKÓW

TESTÓW

BIOCHEMICZNYCH

(KOMERCYJNE

TESTY API)

OKREŚLAJĄCYCH ZDOLNOŚĆ

DROBNOUSTROJÓW DO NP.:

ROZKŁDU

CUKRÓW, ALKOHOLI, ICH

WŁAŚCIWOŚCI

PROTEOLITYCZNE, WYTWARZANIE

ENZYMÓW

IDENTYFIKACJA (2)

•

NA PODSTAWIE OBRAZU MIKROSKOPOWEGO

NAJBARDZIEJ
ROZPOWSZECHNIONE SĄ
KOMERCYJNE BIOCHEMICZNE
TESTY DIAGNOSTYCZNE, NP.:

API 20 E

- PRZEZNACZONE DLA

BAKTERII Z RODZINY
ENTEROBACTERIACEAE

API 20 A

- DLA BAKTERII

BEZTLENOWYCH

API 20E

METODY NIEHODOWLANE

•ODCZYNY IMMUNOLOGICZNE

•METODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ

•TYPOWANIE BAKTERIOFAGAMI

METODY NIEHODOWLANE (1)

ODCZYNY IMMUNOLOGICZNE

• PRECYPITACJI
• AGLUTYNACJI
• IMMUNOFLUORESCENCJI,
• IMMUNOENZYMATYCZNE

ODCZYN PRECYPITACJI

ROZPUSZCZALNE ANTYGENY POLIPEPTYDOWE LUB
WIELOCUKROWE UZYSKUJE SIĘ Z TKANEK LUB Z
DROBNOUSTROJÓW NA DRODZE EKSTRAKCJI
KWASAMI, ENZYMATYCZNIE LUB W PODWYŻSZONEJ
TEMPERATURZE.

DO ICH IDENTYFIKACJI STOSOWANE SĄ W OBECNOŚCI
ELEKTROLITÓW ZNANE SWOISTE PRZECIWCIAŁA.

ZASTOSOWANIE:

OZNACZANIE GRUP SEROLOGICZNYCH
PACIORKOWCÓW
HEMOLIZUJĄCYCH WG LANCEFIELD (IDENTYFIKACJA
WIELOCUKRU C) - PRECYPITACJA OBRĄCZKOWA.

IMMUNOPRECYPITACJA

(IMMUNODYFUZJA) - METODA

ELEKA DO WYKRYWANIA TOKSYNOTWÓRCZOŚCI
MACZUGOWCÓW BŁONICY.

AGLUTYNACJA LATEKSOWA

MIKROCZĄSTECZKI LATEKSU OPŁASZCZONE
SĄ ZNANYMI PRZECIWCIAŁAMI, KTÓRE WIĄŻĄ
SIĘ ZE SPECYFICZNYMI ANTYGENAMI,
DOPROWADZAJĄC DO WIDOCZNEJ GOŁYM
OKIEM AGLUTYNACJI.

WYKONANIE TESTÓW NIE WYMAGA UŻYCIA
CZYSTYCH SZCZEPÓW DROBNOUSTROJÓW.

ZASTOSOWANIE

: IDENTYFIKACJA DWOINEK

ZAPALENIA PŁUC, DO WYKRYWANIA
CZYNNIKÓW ZAPALENIA OPON MÓZGOWO -
RDZENIOWYCH (H. INFLUENZAE, S.
PNEUMONIAE).

AGLUTYNACJA SZKIEŁKOWA

IDENTYFIKACJA NIEZNANYCH SZCZEPÓW
BAKTERYJNYCH,

PRZY UŻYCIU ZNANYCH SWOISTYCH
SUROWIC ODPORNOŚCIOWYCH.

ZASTOSOWANIE:

W DIAGNOSTYCE BAKTERII

Z

RODZAJÓW :

SALMONELLA, SHIGELLA, PSEUDOMONAS,
NEISSERIA.

Coli Lateks EPEC

METODY

IMMUNOFLUORESCENCYJNE

ODCZYN IMMUNOFLUORESCENCJI
BEZPOŚREDNIEJ

PO UTRWALENIU PRÓBKI NAKRAPLA SIĘ
WZORCOWE PRZECIWCIAŁA WYZNAKOWANE
FLUOROCHROMEM. PO OKRESIE INKUBACJI
PREPARAT UMIESZCZA SIĘ W MIKROSKOPIE
FLUORESCENCYJNYM.

JEŚLI W BADANYM MATERIALE ZNAJDOWAŁY
SIĘ SPECYFICZNE DLA WYZNAKOWANYCH
PRZECIWCIAŁ DROBNOUSTROJE, W POLU
WIDZENIA MIKROSKOPU UWIDOCZNI SIĘ
ŚWIECĄCY KOMPLEKS.

ODCZYN IMMUNOFLUORESCENCJI
POŚREDNIEJ

W REAKCJI BIORĄ UDZIAŁ 3 REAGUJĄCE
SUBSTANCJE:

•ZNANY ANTYGEN,
•BADANA SUROWICA,
•ZNAKOWANA FLUOROCHROMEM
ANTYIMMUNOGLOBULINA ZWIERZĘCA
PRZECIW POSZUKIWANYM
PRZECIWCIAŁOM.

METODY IMMUNOFLUOROSCENCYJNE

METODY IMMUNOENZYMATYCZNE (EIA, ELISA)

BEZPOŚREDNIE - BADANE ANTYGENY REAGUJĄ

Z PRZECIWCIAŁAMI, KTÓRE, ZWIĄZANE SĄ Z ENZYMEM
NP.: PEROKSYDAZĄ CHRZANOWĄ.

DLA UWIDOCZNIENIA KOMPLEKSU
ANTYGENU Z PRZECIWCIAŁEM
DODAJE SIĘ ODPOWIEDNIO
DOBRANY SUBSTRAT
I PO INKUBACJI
ODCZYTUJE SIĘ WYNIK
REAKCJI BARWNEJ
JAKOŚCIOWO
LUB ILOŚCIOWO.

METODY POŚREDNIE

ZASTOSOWANIE: DIAGNOSTYKA ZAKAŻEŃ
WYWOŁANYCH PRZEZ DROBNOUSTROJE Z
RODZAJU:

BORRELIA, LEGIONELLA, CHLAMYDIA.

METODY BIOLOGII
MOLEKULARNEJ

POSZUKIWANIE KWASÓW
NUKLEINOWYCH W MATERIALE
KLINICZNYM LUB HODOWLI
DROBNOUSTROJÓW;

•

PCR (METODA POLIMERYZACJI REAKCJI

ŁAŃCUCHOWEJ),

•

HYBRYDYZACJA KWASÓW

NUKLEINOWYCH

PRZY UŻYCIU SOND

MOLEKULARNYCH

METODY NIEHODOWLANE (2)

METODA POLIMERAZOWEJ

REAKCJI ŁAŃCUCHOWEJ (PCR)

POZWALA NA WYKRYCIE ZNIKOMEJ ILOŚCI
DNA W BADANEJ PRÓBCE,

NAWET GDY DROBNOUSTROJE W
MATERIALE ZAKAŹNYM SĄ MARTWE.

HYBRYDYZACJA KWASÓW

NUKLEINOWYCH - PRZY UŻYCIU

SOND

MOLEKULARNYCH.

BADANIE TRWA OK. 2 GODZ. I UMOŻLIWIA
W ZALEŻNOŚCI OD RODZAJU
DROBNOUSTROJU

WYKRYCIE DNA PRZY ILOŚCI 10

3

DROBNOUSTROJÓW.

INNE METODY IDENTYFIKACJI

ANALIZA CHROMATOGRAFI GAZOWEJ

METODA STOSOWANA JEST DO JAKOŚCIOWEGO LUB
ILOŚCIOWEGO ROZDZIAŁU SUBSTANCJI (SKŁADNIKÓW
KOMÓREK BAKTERYJNYCH LUB PRODUKTÓW ICH
METABOLIZMU) O MAŁEJ MASIE CZĄSTECZKOWEJ.

WYSOCE PRECYZYJNA I CZUŁA.

STOSOWANA JEST GŁÓWNIE DO IDENTYFIKACJI
PRODUKTÓW METABOLIZMU BAKTERII
BEZTLENOWYCH (KWASY TŁUSZCZOWE).

POZWALA TEŻ NA SZYBKĄ IDENTYFIKACJĘ GRZYBÓW I
BAKTERII Z RODZAJÓW MYCOBACTERIUM, NEISSERIA.

TYPOWANIE
BAKTERIOFAGAMI

MA NA CELU IDENTYFIKACJĘ
OKREŚLONYCH GATUNKÓW
WYHODOWANYCH BAKTERII (RZADKO)
LUB OZNACZANIE ICH TYPÓW
FAGOWYCH.

OZNACZANIE TYPÓW FAGOWYCH

STOSOWANE JEST W DOCHODZENIU
EPIDEMIOLOGICZNYM, W CELU
USTALENIA ŹRÓDŁA ZAKAŻENIA I DRÓG
SZERZENIA W ŚRODOWISKU
SZPITALNYM I POZASZPITALNYM.

OKREŚLENIE

LEKOWRAŻLIWOŚCI

POZWALA NA WYBÓR CHEMIOTERAPEUTYKU
O

NAJWĘŻSZYM

ZAKRESIE DZIAŁANIA I

NAJWIĘKSZEJ

SKUTECZNOŚCI PRZECIWKO

WYIZOLOWANEMU DROBNOUSTROJOWI.

DOSTĘPNE SĄ KOMERCYJNE METODY
OZNACZANIA LEKOOPORNOŚCI BAKTERII WG
SYSTEMU ATB:

ATB G - DLA RODZINY
ENTEROBACTERIACEAE

ATB - STAPH 5 - DLA GRONKOWCÓW

ATB - ANA - DLA BAKTERII BEZTLENOWYCH

WYKRYWANIE MECHANIZMÓW OPORNOŚCI
BAKTERII NA LEKI - TESTY SPECJALNE

METODA DYFUZYJNO - KRĄŻKOWA

Aglutynacja lateksowa

WYKRYWANIE BIAŁKA PBP 2’ - IDENTYFIKACJA
GRONKOWCÓW OPORNYCH NA METYCYLINĘ
(MRSA, MRCNS)