Analiza RNA i

białek

RNA

•Ryboza ma w RNA
grupę

hydroksylową

przy węglu 2’ przez co
cząsteczki

RNA

są

znacznie

bardziej

reaktywne
i mniej stabilne niż
cząsteczki DNA.
•Wszystkie

komórki

produkują

enzymy

degradujące RNA -
RNazy.
•RNazy są uwalniane
w trakcie lizy komórek
w związku z czym są
obecne na skórze i
przenoszone

przez

dotyk.

Etapy powstawania mRNA

mRNA

Ilość mRNA określonego rodzaju w komórce zależy od:
• wydajności transkrypcji z jego genu
• stabilności cząsteczki RNA

Wydajność transkrypcji genu zależy od wielu czynników

głównie układu białek regulatorowych które wiążą się
sekwencjami regulatorowymi promotora

• Tkankę/chorobę można opisać

przez jej wzór ekspresji genów

• Analizując profil ekspresji genów,

można identyfikować proces na
poziomie molekularnym i lepiej
go zrozumieć

Curan 2002

RNA

Typowa

komórka

ssacza

zawiera 10

-5

μg RNA, z tego

80 – 85% stanowi RNA
rybosomalny (28S, 18S, 5.8S
i 5S).
Większość pozostałej części
stanowią tzw. „małe RNA”
(tRNA, snRNA, RNAi).
Cząsteczki mRNA stanowią
od 1 do 5% populacji RNA.

RNA całkowity, obraz prawidłowy

RNA zdegradowany

Elektroforeza

1. Sterylizacja szkła i plastików przed przystąpieniem

do pracy

2. Przygotowywanie roztworów w czystym szkle

i natychmiastowa sterylizacja w autoklawie

3. Roztwory używane do elektroforezy RNA powinny

być traktowane inhibitorem RNaz, np. DEPC
(Diethylpyrocarbonate) lub przygotowane na wodzie
traktowanej DEPC

4. Naczynie do elektroforezy powinno być również

płukane wodą traktowaną DEPC, najlepiej wydzielić
osobny

aparat

do elektroforezy dla pracy z RNA

5. Roztwory RNA należy trzymać w lodzie w czasie

pracy
a przechowywać w postaci wytrąconej pod etanolem
w temperaturze -70

6. W trakcie pracy z RNA należy zawsze używać

rękawiczek gumowych

Środki ostrożności przy pracy z RNA:

RNazy są enzymami stabilnymi, występują na powierzchni

skóry

i wszędzie gdzie obumierają komórki, dlatego

są na wszystkim czego dotykał człowiek lub zwierzę,

a także w wydychanym powietrzu

Przygotowanie całkowitego RNA

Przygotowanie poliA RNA – chromatografia powinowactwa

Elektroforeza RNA

Elektroforeza RNA

Normalizacja:

•Te same ilości RNA

•Te same ilości powszechnie występujących

transkryptów (tzw. housekeeping genes)

•Te same ilości poliA

RNA

(mierzone

metodami hybrydyzacyjnymi)

•Porównanie z syntetycznym pseudo-mRNA

Standardy masy

•Glioksalowane DNA

•Markery RNA syntetyzowane za pomocą
transkrypcji in vitro

•Rybosomalne RNA

•Denaturacja RNA przed elektroforezą

Analiza sekwencji RNA lub DNA –

detekcja sekwencji nukleotydowych

Masa molekularna

- elektroforeza w żelach

Metoda hybrydyzacji ze znakowana sondą

- znakowanie radioaktywnymi izotopami
-

znakowanie

biotyną

wykrywanie

przeciwciałami przeciw biotynie

• Elektroforeza jest metodą rozdzielania

zarówno cząsteczek DNA jak i RNA

• Detekcja sekwencji nukleotydowych

we fragmentach rozdzielonych drogą

elektroforezy odbywa się poprzez

hybrydyzację ze znakowaną sondą

RT-PCR

Odmiana PCR pozwalająca na
amplifikację RNA

1.Synteza jednoniciowego DNA
komplementarnego do RNA (użycie
odwrotnej transkryptazy )

2. Amplifikacja cDNA (PCR)

RT-PCR

DNA

Etapy PCR:

• denaturacja 92⁰-96⁰ C
• hybrydyzacja – przyłączenie

primerów do matrycy 54⁰ – 56⁰ C

• elongacja – 72⁰ C

PCR

Reverse Transcription PCR

DNA

Białka struktura i funkcja

Badanie struktury i funkcji

białek

oczyszczanie i charakterystyka
oddziaływania białko – DNA,

charakterystyka oddziaływania białko-
białko

ekspresja i modyfikacje w różnych
typach komórek

Białka

Regulacja transkrypcji
Regulacja translacji
Procesy metaboliczne

Białka
składają się z aminokwasów
połączonych wiązaniem
peptydowym

Wiązanie

peptydowe

tworzy

się

między

grupami COOH i NH

kolejnych aminokwasów

aminokwas

1.Kowalencyjna modyfikacja
a: wiązania peptydowego
b: końca N
c: końca C
d: reszt aminokwasowych (łańcuchów bocznych).
2. Modyfikacje niekowalencyjne: zmiana konformacji,
reakcja z kofaktorami
3. Translokacja: selekcja przedziału komórkowego
4. Oddziaływanie z białkami opiekuńczymi w procesach 1,
2, i 3.

Modyfikacje białek powodują

•Nabycie lub utratę funkcji
•Zmianę swoistości oddziaływania z innymi białkami
•Regulację aktywności
•Zmianę biologicznej stabilności

Modyfikacje potranslacyjne białek

Modyfikacje potranslacyjne

• Obróbka potranslacyjna kontroluje prawidłowe
zwijanie, przenoszenie do właściwych obszarów w
komórce, aktywację i stabilność białek

• Najpowszechniejsze formy modyfikacji to:

• proteoliza
• fosforylacja
• glikozylacja
• acetylacja
• metylacja
• poli(ADP)rybozylacja
• wiązanie metali

• Białka opiekuńcze (białka stresu) uczestniczą w
prawidłowym zwijaniu i składaniu kompleksów
nowozsyntetyzowanych białek

Fosforylacja jest przykładem najpowszechniej

występującego typu modyfikacji posttranslacyjnej

Kinazy
serynowo-
treoninowe

Kinazy
tyrozynowe

Izolacja białek – liza komórek

Podstawowe metody lizowania komórek różnych typów:
Liza mechaniczna

Homogenizacja

Homogenizator nożowy (mikser)
Homogenizator Dounce’a
Homogenizator Pottera-Elvehjem’a

Sonikacja
Mrożenie /rozmrażanie
Moździerz

Liza z udziałem detergentów

Jonowych: SDS
Niejonowych (lub podwójnie jonowych): Triton X- , Nonidet
CHAPS

CHAPS

Dializa jest najprostszą metodą

oczyszczania roztworów białek z

substancji niskocząsteczkowych

Selekcja odpowiedniej błony dializacyjnej
- MWCO (molecular weight cut off)
- Odpowiednia objętość i mieszanie buforu
dializacyjnego

Małe cząsteczki białka
i jony przechodzą
przez pory w błonie
dializacyjnej i
stopniowo zmniejsza
się ich stężenie w
roztworze

Białka o dużej masie (na
rys. immunoglobulina )
pozostają wewnątrz
przestrzeni ograniczanej
błoną dializacyjną.

Nowsze komory dializacyjne pozwalają na dializę
niewielkich objętości mieszanin białkowych

W wielu przypadkach konieczne jest odsalanie
białek przy zachowaniu małej objętości próby.
Do tego celu stosuje się sita molekularne

Niektóre zanieczyszczenia: endotoksyny lub
albuminę usuwa się przy pomocy chromatografii
powinowactwa

Detergenty ulegające dializie: SDS, CHAPS

Metody oznaczania białek:

• UV (280 nm)

• Kolorymetryczne

Lowry
Coomassie
BCA

• Ekstrakcja buforami ułatwiającymi

uzyskanie frakcji białek o
pożądanych właściwościach

Izolacja białek

Selektywne wytrącanie

Opiera się na różnicach w rozpuszczalności białek.
Rozpuszczalność zależy od względnej równowagi między
oddziaływaniami białko-rozpuszczalnik, które utrzymują
białko w stanie rozpuszczonym i oddziaływaniami białko-
białko, które powodują agregację i strącanie białek. Siła
jonowa roztworu decyduje o tym, który typ oddziaływań
dominuje.

Wytrącanie siarczanem amonu

Niska siła jonowa (niskie stężenie siarczanu amonu) –
sprzyja

oddziaływaniom

białko-rozpuszczalnik;

białka

pozostają w roztworze
Wysoka siła jonowa (duże stężenie siarczanu amonu) –
sprzyja oddziaływaniom białko-białko, białka agregują i
wytrącają się

Stopniowe dodawanie siarczanu amonu do ekstraktu
białkowego prowadzi do selektywnej precypitacji różnych
typów białek. Białka niepożądane są odrzucane. Proces jest
powtarzany dopóki nie wytrącimy frakcji białek, która nas
interesuje. Wytrącone białka mogą zostać ponownie
rozpuszczone.

Wytrącanie roztworem TCA (kwas
trójchlorooctowy)

Metoda pozwala na selektywną izolację pewnych białek (np.
białek HMG)

Ładunek w białkach

Grupy karboksylowe
Grupy aminowe

Elektroforeza pionowa

(DNA, białka)

Elektroforeza pozioma

(kwasy nukleinowe)

Elektroforeza natywna

Oznaczanie masy białka odbywa się w żelach

nieciągłych i denaturujących (w obecności

SDS)

Elektroforeza nieciągła

Schemat żelu do elektroforezy nieciągłej.
Oba żele maja różny skład elektrolitów, wartość
pH
oraz porowatość.

Elektroforeza białek

w warunkach denaturujących:

próby oraz bufor zawierają odczynnik

denaturujący białko (np. SDS lub mocznik)

Nanoszenie próby

Przy pomocy elektroforezy w żelu

poliakrylamidowym (SDS-PAGE) można

oszacować rozmiar nieznanego białka

Przykład wyniku elektroforezy

białek

w obecności SDS; zdjęcie

zabarwionego żelu

M. Marker

białkowy

1. Ekstrakt z

hodowli

2. Oczyszczone

białko

Elektroforeza z ogniskowaniem w

punkcie izoelektrycznym

(Isoelectric

Focusing)

Zasada rozdziału:
Zmiana ładunku elektrycznego cząsteczek
białkowych w zależności od pH roztworu, w którym
znajdują się cząsteczki

Przygotowywany w rurkach żel zawiera mieszaninę
amfolitów, które w polu elektrycznym wytwarzają
gradient pH.

Białka zatrzymują się podczas elektroforezy w
miejscu żelu
gdzie pH =punktowi izoelektrycznemu

Elektroforeza z ogniskowaniem w punkcie

izoelektrycznym jest używana jako pierwszy

etap elektroforezy dwukierunkowej

Elektroforeza dwukierunkowa

Transfer elektroforetyczny

Izolacja białek

Metody rozdzielania białek

Selektywna precypitacja
Chromatografia

jonowymienna
filtracja na żelu
chromatografia powinowactwa

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym

SDS-PAGE
z ogniskowaniem izoelektrycznym
dwuwymiarowa

Chromatografia; zasady ogólne:

Mieszanina białek jest frakcjonowana w trakcie
ruchu przez porowate podłoże. Białka oddziałują z
dwoma fazami: ruchomą – rozpuszczalnikiem i
stałą – podłożem. Podłoże zawiera miejsca
wiązania białek. Wiązanie pojedynczych białek do
podłoża opóźnia ich ruch. Im większe
powinowactwo białka do podłoża tym wolniej
wędruje przez złoże podczas chromatografii.

Chromatografia kolumnowa
Złoże upakowane w kolumnie. Rozpuszczalnik
przechodząc przez kolumnę porywa cząsteczki
białka (ruch w dół kolumny)
Chromatografia cienkowarstwowa
Cienka warstwa złoża naniesiona na płytkę szklaną
lub celuloidową
Rozpuszczalnik wędruje ze zbiornika do góry
płytki
Białka o najmniejszym powinowactwie do złoża
wędrują z czołem rozpuszczalnika

Chromatografia kolumnowa

Chromatografia

cienkowarstwowa

(bibułowa)

jonowymienna

Chromatografia jonowymienna

Podstawą rozdziału są różnice w ładunku elektrycznym. Całkowity
ładunek białka zależy od sumy ładunków poszczególnych
aminokwasów i zależy od pH. Punktem izoelektrycznym białka
nazywamy pH w którym białko jest neutralne

Zwiększenie siły jonowej
powoduje osłabienie
wiązania podłoże-białko
i wymywanie
poszczególnych frakcji