Sekwencjonowanie DNA

•Reakcje prowadzi się w czterech 
probówkach. Do każdej mieszaniny 
reakcyjnej dodaje się inne, 
dideoksynukleotydy które nie posiadają 
grupy -OH przy 3’ węglu. Dołączenie 
nukleotydu bez grupy 3’-OH uniemożliwia 
dołączanie kolejnych nukleotydów. W ten 
sposób powstają fragmenty o różnej 
długości. 

•W probówce z dideoksy- ATP uzyskuje się 
fragmenty różnej długości mające na 
końcu dideoksy-ATP. 

•Po elektroforezie w wysokorozdzielczym 
żelu poliakrylamidowym, uzyskujemy 
uporządkowany wzór prążków 
rozdzielonych pod względem wielkości. 

Polega na ustaleniu kolejności par zasad w 
badanej cząsteczce DNA. 

Obecnie najczęściej wykorzystywaną jest 
metoda Sangera polegająca na enzymatycznej 
syntezie cząsteczek DNA. 

2

 

 

3

 

 

4

 

 

Automatyczne 
sekwencjonowanie 

5

 

 

Analiza wyników 
sekwencjonowania

10

 

 

Substytucja
HOMOZYGOTA

Sekwencja z  mutacją 

Sekwencja bez  mutacji 
(dzika) 

Sekwencja bez  mutacji (dzika)

Sekwencja z  mutacją 

Sekwencja wzorcowa

 

Sekwencja z mutacją
(forward)

Sekwencja z mutacją
(reverse)

Jaka jest to mutacja na poziomie DNA? 

substytucja adeniny w guaninę

Homozygota czy heterozygota?

homozygota

Co powoduje na poziomie białka?

mutacja zmiany sensu („missense”) Lys w Glu

CCA CCT GTA GTA CAT AAA AAC CCA ATC CAC

CCA CCT GTA GTA CAT 

G

AA AAC CCA ATC CAC

 

Pro   Pro   Val  Val   His   Lys  Asn  Pro  Ile    His

Pro   Pro  Val   Val  His  

Glu

   Asn  Pro   Ile   His

CCA CCT GTA GTA CAT 

G

AA AAC CCA ATC CAC

Pro   Pro  Val   Val  His  

Glu

   Asn  Pro   Ile   His

11

 

 

Co z tym reverse ?

Reverse 5’-3’ (zastosowano funkcje Reverse+Complement)

Reverse 3’-5’ (nie zastosowano funkcji Reverse+Complement)

12

 

 

Substytucja
HETEROZYGOTA

Sekwencja z  mutacją 

Sekwencja bez  mutacji 
(dzika) 

Sekwencja bez  mutacji (dzika)

Sekwencja z  mutacją 

Sekwencja wzorcowa 

Sekwencja z mutacją
(forward)

Sekwencja z mutacją
(reverse)

Jaka  jest to mutacja na poziomie DNA? 

substytucja guaniny w adeninę

Homozygota czy heterozygota?

heterozygota

Co powoduje na poziomie białka?

mutacja zmiany sensu („missense”) Gly w Asp

CCT CCC GAC GCA GGT GAG CCC GCC GGC CCC

Pro  Pro   Asp  Ala   Gly   Glu   Pro   Ala   Gly   Pro

CCT CCC GAC GCA G   T GAG CCC GCC GGC CCC

A

G

A

CCT CCC GAC GCA G   T GAG CCC GCC GGC CCC

A

G

Pro  Pro   Asp  Ala   

Asp 

  Glu   Pro   Ala   Gly   Pro

Pro  Pro   Asp  Ala   

Asp 

  Glu   Pro   Ala   Gly   Pro

13

 

 

Delecja
HOMOZYGOTA

Sekwencja z  mutacją 

Sekwencja bez  mutacji 
(dzika) 

Sekwencja bez  mutacji (dzika)

Sekwencja z  mutacją 

Sekwencja wzorcowa

 

Sekwencja z mutacją
(forward)

Sekwencja z mutacją
(reverse)

Jaka jest to mutacja na poziomie DNA? 

delecja 14 nukleotydów

Homozygota czy heterozygota?

homozygota

Co powoduje na poziomie białka?

GAG AAG AAG AGG AAG TTC ATC AAG GGG GAG ATA

 

Glu  Lys  Lys   Arg   Lys  Phe  Ile    Lys  Gly    Glu  Ile

  

GAG AAG AAG AGG 

GGA GAT AAA GAG TGA ATT TAA

 Glu  Lys  Lys   Arg   

Gly   Asp  Lys  Glu  Stop

  

GAG AAG AAG AGG 

GGA GAT AAA GAG TGA ATT TAA

 Glu  Lys  Lys   Arg   

Gly   Asp  Lys  Glu  Stop

  

zmiana ramki odczytu („frameshift”) / mutacja braku sensu („nonsense”)

 

14

 

 

Delecja
HETEROZYGOTA

Sekwencja z  mutacją 

Sekwencja bez  mutacji 
(dzika) 

Sekwencja bez  mutacji (dzika)

Sekwencja z  mutacją 

Sekwencja wzorcowa

 

Sekwencja z mutacją
(forward)

Sekwencja z mutacją
(reverse)

Jaka jest to mutacja na poziomie DNA? 

delecja guaniny

Homozygota czy heterozygota?

heterozygota

Co powoduje na poziomie białka?

GGC ACG CTG CAG ACG ATC CTG GGG GGT GTG AAC

 

Gly  Thr   Leu  Gln  Thr   Ile    Leu  Gly   Gly   Val   Asn

  

zmiana ramki odczytu („frameshift”) / mutacja braku sensu („nonsense”)

 

GGC ACG CTG CAG ACG ATC CTG GGG G

 Gly  Thr   Leu  Gln  Thr   Ile    Leu  Gly   

Val   Stop

  

GGC ACG CTG CAG ACG ATC CTG GGG GGT GTG AAC

 Gly  Thr   Leu  Gln  Thr   Ile    Leu  Gly   

Val   Stop

  

 G

G

 G

G

A    AC

 

T

T  

T

T

G

    

AA

GGC ACG CTG CAG ACG ATC CTG GGG 

GTG TGA AC

GGC ACG CTG CAG ACG ATC CTG GGG G

 G

G

  GT

A

  A

 

T

T   

TG

G A

GGC ACG CTG CAG ACG ATC CTG GGG 

GTG TGA AC

15