Sekwencjonowanie DNA

•Reakcje prowadzi się w czterech
probówkach. Do każdej mieszaniny
reakcyjnej dodaje się inne,
dideoksynukleotydy które nie posiadają
grupy -OH przy 3’ węglu. Dołączenie
nukleotydu bez grupy 3’-OH uniemożliwia
dołączanie kolejnych nukleotydów. W ten
sposób powstają fragmenty o różnej
długości.

•W probówce z dideoksy- ATP uzyskuje się
fragmenty różnej długości mające na
końcu dideoksy-ATP.

•Po elektroforezie w wysokorozdzielczym
żelu poliakrylamidowym, uzyskujemy
uporządkowany wzór prążków
rozdzielonych pod względem wielkości.

Polega na ustaleniu kolejności par zasad w
badanej cząsteczce DNA.

Obecnie najczęściej wykorzystywaną jest
metoda Sangera polegająca na enzymatycznej
syntezie cząsteczek DNA.

2

3

4

Automatyczne
sekwencjonowanie

5

Analiza wyników
sekwencjonowania

10

Substytucja
HOMOZYGOTA

Sekwencja z mutacją

Sekwencja bez mutacji
(dzika)

Sekwencja bez mutacji (dzika)

Sekwencja z mutacją

Sekwencja wzorcowa

Sekwencja z mutacją
(forward)

Sekwencja z mutacją
(reverse)

Jaka jest to mutacja na poziomie DNA?

substytucja adeniny w guaninę

Homozygota czy heterozygota?

homozygota

Co powoduje na poziomie białka?

mutacja zmiany sensu („missense”) Lys w Glu

CCA CCT GTA GTA CAT AAA AAC CCA ATC CAC

CCA CCT GTA GTA CAT

G

AA AAC CCA ATC CAC

Pro Pro Val Val His Lys Asn Pro Ile His

Pro Pro Val Val His

Glu

Asn Pro Ile His

CCA CCT GTA GTA CAT

G

AA AAC CCA ATC CAC

Pro Pro Val Val His

Glu

Asn Pro Ile His

11

Co z tym reverse ?

Reverse 5’-3’ (zastosowano funkcje Reverse+Complement)

Reverse 3’-5’ (nie zastosowano funkcji Reverse+Complement)

12

Substytucja
HETEROZYGOTA

Sekwencja z mutacją

Sekwencja bez mutacji
(dzika)

Sekwencja bez mutacji (dzika)

Sekwencja z mutacją

Sekwencja wzorcowa

Sekwencja z mutacją
(forward)

Sekwencja z mutacją
(reverse)

Jaka jest to mutacja na poziomie DNA?

substytucja guaniny w adeninę

Homozygota czy heterozygota?

heterozygota

Co powoduje na poziomie białka?

mutacja zmiany sensu („missense”) Gly w Asp

CCT CCC GAC GCA GGT GAG CCC GCC GGC CCC

Pro Pro Asp Ala Gly Glu Pro Ala Gly Pro

CCT CCC GAC GCA G T GAG CCC GCC GGC CCC

A

G

A

CCT CCC GAC GCA G T GAG CCC GCC GGC CCC

A

G

Pro Pro Asp Ala

Asp

Glu Pro Ala Gly Pro

Pro Pro Asp Ala

Asp

Glu Pro Ala Gly Pro

13

Delecja
HOMOZYGOTA

Sekwencja z mutacją

Sekwencja bez mutacji
(dzika)

Sekwencja bez mutacji (dzika)

Sekwencja z mutacją

Sekwencja wzorcowa

Sekwencja z mutacją
(forward)

Sekwencja z mutacją
(reverse)

Jaka jest to mutacja na poziomie DNA?

delecja 14 nukleotydów

Homozygota czy heterozygota?

homozygota

Co powoduje na poziomie białka?

GAG AAG AAG AGG AAG TTC ATC AAG GGG GAG ATA

Glu Lys Lys Arg Lys Phe Ile Lys Gly Glu Ile

GAG AAG AAG AGG

GGA GAT AAA GAG TGA ATT TAA

Glu Lys Lys Arg

Gly Asp Lys Glu Stop

GAG AAG AAG AGG

GGA GAT AAA GAG TGA ATT TAA

Glu Lys Lys Arg

Gly Asp Lys Glu Stop

zmiana ramki odczytu („frameshift”) / mutacja braku sensu („nonsense”)

14

Delecja
HETEROZYGOTA

Sekwencja z mutacją

Sekwencja bez mutacji
(dzika)

Sekwencja bez mutacji (dzika)

Sekwencja z mutacją

Sekwencja wzorcowa

Sekwencja z mutacją
(forward)

Sekwencja z mutacją
(reverse)

Jaka jest to mutacja na poziomie DNA?

delecja guaniny

Homozygota czy heterozygota?

heterozygota

Co powoduje na poziomie białka?

GGC ACG CTG CAG ACG ATC CTG GGG GGT GTG AAC

Gly Thr Leu Gln Thr Ile Leu Gly Gly Val Asn

zmiana ramki odczytu („frameshift”) / mutacja braku sensu („nonsense”)

GGC ACG CTG CAG ACG ATC CTG GGG G

Gly Thr Leu Gln Thr Ile Leu Gly

Val Stop

GGC ACG CTG CAG ACG ATC CTG GGG GGT GTG AAC

Gly Thr Leu Gln Thr Ile Leu Gly

Val Stop

G

G

G

G

A AC

T

T

T

T

G

AA

GGC ACG CTG CAG ACG ATC CTG GGG

GTG TGA AC

GGC ACG CTG CAG ACG ATC CTG GGG G

G

G

GT

A

A

T

T

TG

G A

GGC ACG CTG CAG ACG ATC CTG GGG

GTG TGA AC

15