0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

%

p

rz

ez

yc

ia

DMS (mM)

DMS
DMS+NaOH

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0

50

100

150

200

250

300

M

F

x1

0

-4

DMS (mM)

DMS
DMS+NaOH

Naprawa DNA

Przez odwrócenie –

bezbłędna

1.Fotoliaza

(dimery pirymidynowe)

2.Transferaza O

6

-MeG

3.AlkB

(3MeC, 1MeA)

Bezpośrednie usuwanie uszkodzeń

DNA bez naruszania integralności

podwójnej helisy

Fotoreaktywac

ja

fotoliazy

Dimer
pirymidyno
wy (CPD)

6,4-fotoprodukt

UV

Bezpośrednie usuwanie uszkodzeń DNA
bez naruszania integralności podwójnej

helisy

Odmienne typy fotoliazy mogą usuwać specyficznie tylko
jeden typ uszkodzeń. E. coli posiada enzym rozrywający
podwójne wiązanie w CPD.

Fotoliaza E. coli

jest monomerycznym białkiem o masie

cząsteczkowej ok. 60 kDa, zawierającym chromofor – (5,10-
metenylo-tetrahydrofolilo)poliglutaminian (MTHF)
ulegający wzbudzeniu przez światło widzialne o długości
300 nm i rozrywające pierścień cyklobutanowy CPD.

10 – 20 cząsteczek na komórkę E.coli

Enzym powolny

Fotoliazy

– obecne u bakterii, niższych eukariontów, w

roślinach, ale brak ich u ssaków łożyskowych

Aktywność fotoliazy zmniejsza toksyczność i
poziom mutacji indukowanych światłem UV

NER u bakterii

Wycinane są 12-13 nukleotydowe fragmenty DNA

Mutanty uvr są nadwrażliwe na

promieniowanie UV

NER u ssaków

Wycinane są 25 – 27 nukleotydowe fragmenty

NER

u

ssaków

c.d.

Xeroderma pigmentosum

(XP)



Nadwrażliwość na

promieniowanie
słoneczne;

wysoka

zapadalność na raka
skóry; defekt w GGR

Usuwa

uszkodzenia

DNA z całego

genomu

GGR

Demetylacja przez O

6

-alkiloguanylo-

alkilotransferazę (Ada – u E.coli, AGT -

ssaki)

O

6

MeG

G

AG
T

Bezpośrednie usuwanie uszkodzeń DNA bez

naruszania integralności podwójnej helisy

Usuwanie grup alkilowych

AGT i Ada

– białka samobójcze; ulegają

inaktywacji po przeniesieniu grup metylowych z
DNA na grupy –SH Cys (Cys69 i 321 w białku
Ada)

Bezpośrednie usuwanie uszkodzeń

DNA bez naruszania integralności

podwójnej helisy

oksydacyjna naprawa zmetylowanych zasad

DNA – białko AlkB

AlkB naprawia
ssDNA.

1-meA & 3-

meC

są substratami

AlkB

AlkB należy do rodziny
dioksygenaz
ketoglutaranu

zależnych od Fe

2

+

AlkB wymaga Fe(II) jako
kofaktora, a także -

ketoglutaranu i O

2

jako

kosubstratów

Mechaniz

m reakcji

AlkB

Prof.Sedgwick’s group, Nature 2002

Prof.Seeberg’s group, Nature 2002

Bezpośrednie usuwanie uszkodzeń

DNA bez naruszania integralności

podwójnej helisy

oksydacyjna naprawa zmetylowanych

zasad DNA – białko AlkB

W komórkach człowieka – 8 homologów AlkB

ABH2 –

specyficzny względem dsDNA; naprawia

głównie

1MeA

ABH3 –

specyficzny względem ssDNA oraz RNA;

naprawia

głównie

3MeC

AlkB

1MeA

Czas (godz)

30

ABH2

-

ABH3

-

podstawowy

Akumulacja

1MeA

z

wiekiem u myszy

ABH2

–

, ale nie

u ABH3

–

Endogenna metylacja
DNA

Kinetyka naprawy 1MeA w
komórkach myszy typu
podstawowego, ABH2

-

i

ABH3

-

Każda grupa robi jedno doświadczenie

1. AB 1157 – naświetlamy UV 3 min

2. BH 200 (AB1157 uvrA)

-

- UV 3 sek

3. BH 200 - UV 6 sek

Szczepy są zawieszone w MgSO

4

Liczenie wyników poprzedniego ćwiczenia:

Wyniki wpisywać do Tabelki