Chandra S. Pareek

 Novel approaches for linkage 

mapping in dairy cattle. 

”Selective DNA pooling”

 

 

Main sub-headings

 Definition
  Principle
  Experimental design
 
  Experimental  design  to  locate  the  QTL  region  through  selective 

DNA pooling.

 
 Microsatellite genotyping
 
 Statistical methods for accurate estimation of gene frequency from 

pooled samples.

 
 Problems in determination of gene frequency.
 
 Problems in interpreting pooling results by visual inspection.
 
 Application of Selective DNA pooling in farm animals.
 
 Advantages of Selective DNA pooling.
 
 Success of selective DNA pooling in dairy cattle.

 

 

Definitio

n 

•  
“Selective  DNA  pooling”  is  an  advanced 

methodology 

for 

linkage 

mapping 

of 

quantitative,  binary  and  complex  traits  in 
farm animals.

•  
 In human, this methodology is termed as DNA 

pooling  where  it  serves  as  mapping  of 
complex disease traits.

•  
It  is  defined  as  densitometric  genotyping  of 

physically 

pooled 

samples 

from 

phenotypically extreme individuals.

•  
The DNA pooling is performed  by taking equal 

aliquots of DNA from the pooled individuals. 

 

 

Principle

•  
      The  principle  is  based  on  densitometric  estimates  of  marker 

allele  frequency  from  the  pooled  phenotypically  extreme 

individuals.

•  






    

    In this regards, the marker of choice is: 

STR or microsatellite 

STR or microsatellite 

markers.

markers.

•  
      The  microsatellite  allele  linked  to  any  QTL  gene  can  be 

identified by any shift or deviation of allele from the pools.

•  
     The QTL linked allele, and then further tested for its feasibility 

by statistical analysis.

•  
      The  power  of  statistics  is  relied  on  the  accurate  estimates  of 

gene frequency from the pooled samples.

•  
      Several  methods  have  been  described  for  accurate  estimation 

of  gene  frequencies  (Daniels  et  al.  1998,  Barcellos  et  al.  1998, 

Lipkin et al. 1998, and Collins et al. 2000).

•  

 

 

Figure A and B: showing allelic patterns  
of a linked  marker. 

Here figure A is displaying a shift of 
marker allelein affected individuals pool.   

Figure C and D: showing allelic 
patterns  of a unlinked  marker.

Here both figures are  not displaying 
any shift or deviation of the alleles.  

Affected pool

Unaffected pool

Unaffected pool

Affected pool

 

 

Experimental design

 

  A well-defined experimental design is an essential prerequisite 

to perform the selective DNA pooling.

•  
  The experimental design should include the following 

conditions.

• 1.  Identification  of  resource  families  having  extreme 

phenotypic values for the given analysed trait.

• 2. Systemic selection of highly polymorphic STR markers from 

the analysed genome.

•  
  Experimental  design  to  locate  the  QTL  region  through 

selective DNA pooling

•  

 Daughter design: In case of cattle, by utilizing multiple half-
sib  families with multiple STR markers.
 Granddaughter design: In case of cattle, poultry and swine, 
by  utilizing  F2  full-sib  daughters  including  sire  and  grand 
sire.

 

 

Microsatellite 

genotyping

•  

The  most  commonly  used  touch 

down protocol of Don et al. 1991, can 
be  used  for  typing  of  microsatellte 
markers,  followed  by  visualisation  of 
electrophoresis  results  in  any  DNA 
sequencing  machine  (Perkin  Elmer 
ABI-Prism, 

Pharmacia 

ALF, 

and 

LICOR genetic analyser).

 

 

 Statistical methods for accurate 

estimation of gene frequency from 

pooled samples

 The following three methods have been 

described:

 
  By measuring the relative intensity of 

shadow bands (RI):
Method proposed by Lipkin et al. 1998.

  

By  measuring  the  Allelic  Image  Pattern 

(AIP) from the pools:
Method proposed by Daniels et al. 1998.

 
  By measuring the Total Allelic content 

(TAC) from the pools:
Method proposed by Collins et al. 2000.

 

 

first Method: Lipkin et al. 1998

Measuring relative intensity of shadow 
bands (RI)

By  giving  the  densitometric  values  of  main  and 
shadow  bands,  the  relative  intensity  of  a  given 
shadow  band  for  a  given  allele  can  be  calculated 
as:
RI

n.i

 = D

n.i

 / D

n

Where,

n = is the number of repeats in the native genomic 
tract of the allele A

n

I = is the order of the shadow band
RI

n.i

  =  is  the  relative  intensity  of  the  i

th

  shadow 

band derived from the genomic tract of A

n

 

D

n

  =  is  the  densitometric  intensity  of  the  main 

band derived from the genomic tract of A

n

D

n.i

 =is the densitometric intensity of the i

th

 shadow 

band derived from the genomic tract of A

n

 

 

2nd method: Daniels et al.. 1998

Measuring Allelic Image Patterns 
(AIP) from the pools

• The principle of this method is based on the 

analysis of microsatellite allele image patterns 
(



AIP) generated from the DNA pools.

• The

 

AIP statistic is calculated from the 

differences in the area between two allele 

image pattern expressed as a fraction of total 

shared and non-shared area.

 

AIP = Dif / (Dif + Com)

The 

 

AIPs from the pools and X

2 

values from 

individual genotyping were compared. The 

results demonstrated a high correlation 
between 

 

AIPs and X

2 

values.

 

 

Figure showing overlaid AIPsof two different pools amplified with the 

microsatellitemarker. Area ”Dif” and ”Com” are the non-shared and 

common areas betweenthe two AIPs.

 

 

3rd method: Collins et al.. 2000

Measuring Total Allelic content 
(



TAC) from the pools

• This is a modified method of Daniels et al.. 

1998.

• The principle of this method is based on 

simple measurement of total allele 
differences by comparing the two pools.

• The pool comparison is done by comparing 

the relative peak height differences 
between electrophoregrams for each allele 
of a microsatellite.

 

 

FigureA: Showing peak image profile from individual genotyping 
illustrating sutter profile and amplitude variation.
Figure B: showing peak image profiles from pooled genotyping. 

 

 

Problems in determination of 

gene frequency

Feasibility and reliability of selective 

DNA  pooling  is  depend  upon  the 

accurate  estimates  of  the  gene 

frequency  from  pooled  samples, 

which  is  mostly  confounded  with 

Sutter  banding  and  Differential 

amplification.

• 1. Sutter banding
• 2. Differential amplification.

 

 

Problems in interpretating 

pooling results by visual 

inspection

Visual inspection of numerous STR 
genotyping of pooled samples can 
be performed by visual eye balling 
of the peak image files.
There are 2 problems encountered 
during visual inspection of the 
peak image files.

True negative peaks 

False positive peaks

 

 

Figure1: Showing shifting of 
microsatelliteallele in affected group. 

This figure represents the True result 
with correct peak profile image.

Figure3: Showing no shifting of 
microsatellitealleles but there is one 
linked marker allele in this locus.

This figure represents  a good example of 
True Negative peak profile image.

Shifted allele

control

unaffected

False .Shifted allele

Figure2: Showing shifting of 
microsatelliteallele in affected group.

This figure represents a good example 
of False positive peak profile image.

Example of correct result

Example of false positive result

Example of true negative result

 

 

Application of selective DNA pooling 

in farm animals

In rapid genome scanning for the identification of 

unknown gene or linked gene fragment.

  
In rapid estimation of STR gene frequency. More 

recently in estimation of SNP frequencies as well.

 
In identification of complex gene fragment within 

the genome through linkage analysis of STR 

marker linked to that gene fragment.

In QTL mapping of the identified gene or gene 

fragment.

To detect genes with small effect, for e.g., complex 

disease traits in human.

 
 

 

 

Figure representing detection of linked allele by comparing affected and 
unaffected DNA pools.
In this figure: Marker D5S393 is showing the linked allele to the disease 
trait whereas, marker D5S410 showing no allele linked to the disease trait.

 

 

Advantages of selective 

DNA pooling

 
To detect any linkage between marker and QTL: 
Multiple  families  with  large  numbers  of  daughters 

are required to get reasonable statistical power.

 
This requirement leads to genotyping of hundreds of 

thousands 

individuals 

with 

high 

cost 

of 

experiment.

 
By  means  of  selective  DNA  pooling,  the  cost  of 

numerous 

genotyping 

can 

be 

substantially 

reduced.

 
Thus selective DNA pooling is an ideal and potential 

approach for analysing multiple large families with 

multiple microsatellite markers.

 
 

 

 

    Selective  DNA  pooling  reduces  not  only  the 

genotype  cost  by  many  folds,  but  also 

minimizes the valuable experimental time.

 For example:individual v/s Pooled genotyping
In  case  of  individual  G:  2000  markers  x  2000 

individuals = 4 x 10

6 

 individuals

In  case  of  Pooled  G:  The  genotyping  becomes 

2000 x 2 = 4000.

 Success of selective DNA pooling in 

dairy cattle

 

   Mapping  of  QTL  genes  for  milk  protein 

percentage  in  Israeli  HF  cattle  (Lipkin  et  al. 

1998).

 
  Detection of loci that affect quantitative traits 

like  milk  production  in  New  Zealand  HF  and 

Jersey cattle population (Spelman et al. 1998).