Chromatografia

Chromatografia

-

-

(gr. chromatos = barwa + grapho

(gr. chromatos = barwa + grapho

= pisze) to technika analityczna

= pisze) to technika analityczna

lub preparatywna służąca do

lub preparatywna służąca do

rozdzielania lub badania składu

rozdzielania lub badania składu

mieszanin związków

mieszanin związków

chemicznych.

chemicznych.

W każdej technice chromatograficznej
najpierw rozdziela się badaną
mieszaninę, a następnie przeprowadza
się detekcję (wykrywanie)
poszczególnych składników. Rozdział
substancji następuje w wyniku
przepuszczenia roztworu badanej
mieszaniny przez specjalnie
spreparowaną fazę rozdzielczą (złoże),
zwaną też fazą stacjonarną. Fazą
rozdzielczą są substancje wykazujące
zdolności sorpcyjne lub zdolne do
innych oddziaływań na substancje
przepływające.

Podczas przepływu

eluenta

(fazy

ruchomej) przez fazę rozdzielczą
następuje proces wymywania
zaadsorbowanych (lub związanych)
substancji. Intensywność tego procesu
jest różna dla poszczególnych
składników mieszaniny. Jedne
składniki są więc zatrzymywane w
fazie dłużej, a inne krócej, dzięki
czemu może następować ich
separacja. Czas przebywania danego
składnika w kolumnie określany jest
mianem

czasu retencji

.

W zależności od rodzaju

W zależności od rodzaju

eluentu

eluentu

czyli substancji w której

czyli substancji w której

rozpuszcza się badaną

rozpuszcza się badaną

mieszaninę rozróżnia się

mieszaninę rozróżnia się

następujące techniki

następujące techniki

chromatograficzne:

chromatograficzne:



chromatografia cieczowa

chromatografia cieczowa

- w której

- w której

eluentem jest ciekły rozpuszczalnik

eluentem jest ciekły rozpuszczalnik



chromatografia gazowa

chromatografia gazowa

- w której

- w której

eluentem jest gaz (zwykle wodór lub hel).

eluentem jest gaz (zwykle wodór lub hel).



chromatografia nadkrytyczna

chromatografia nadkrytyczna

- w

- w

której eluentem jest gaz w stanie

której eluentem jest gaz w stanie

nadkrytycznym.

nadkrytycznym.

W zależności od parametrów

W zależności od parametrów

procesu:

procesu:



HPLC

HPLC

- wysokosprawna/ciśnieniowa

- wysokosprawna/ciśnieniowa

chromatografia cieczowa - odmiana

chromatografia cieczowa - odmiana

cieczowej chromatografii kolumnowej z

cieczowej chromatografii kolumnowej z

użyciem eluenta pod wysokim ciśnieniem;

użyciem eluenta pod wysokim ciśnieniem;



FPLC

FPLC

- szybka, białkowa/szybkosprawna

- szybka, białkowa/szybkosprawna

chromatografia cieczowa - odmiana HPLC

chromatografia cieczowa - odmiana HPLC

działająca na niższych ciśnieniach,

działająca na niższych ciśnieniach,

stosująca prócz złóż sorpcyjnych, także

stosująca prócz złóż sorpcyjnych, także

zwykłe złoża typu sit molekularnych,

zwykłe złoża typu sit molekularnych,

służąca głównie do rozdziału białek i

służąca głównie do rozdziału białek i

polipeptydów. Opatentowana i wyłączna

polipeptydów. Opatentowana i wyłączna

nazwa dla firmy Pharmacia.

nazwa dla firmy Pharmacia.

W zależności od rodzaju i

W zależności od rodzaju i

sposobu przygotowania fazy

sposobu przygotowania fazy

rozdzielczej:

rozdzielczej:



chromatografia bibułowa

chromatografia bibułowa

- w której

- w której

fazę rozdzielczą stanowi pasek lub

fazę rozdzielczą stanowi pasek lub

arkusz bibuły filtracyjnej lub specjalnego

arkusz bibuły filtracyjnej lub specjalnego

typu bibuły chromatograficznej;

typu bibuły chromatograficznej;



chromatografia kolumnowa

chromatografia kolumnowa

- w której

- w której

faza rozdzielcza jest umieszczona w

faza rozdzielcza jest umieszczona w

specjalnej kolumnie, przez którą

specjalnej kolumnie, przez którą

przepuszcza się następnie roztwór

przepuszcza się następnie roztwór

badanej mieszaniny. Przepływ roztworu

badanej mieszaniny. Przepływ roztworu

przez kolumnę można wymuszać

przez kolumnę można wymuszać

grawitacyjnie lub stosując różnicę

grawitacyjnie lub stosując różnicę

ciśnień na wlocie i wylocie kolumny;

ciśnień na wlocie i wylocie kolumny;



chromatografia powinowactwa

chromatografia powinowactwa

- w

- w

której odpowiednio spreparowana

której odpowiednio spreparowana

faza rozdzielcza jest zdolna do

faza rozdzielcza jest zdolna do

oddziaływań chemicznych o

oddziaływań chemicznych o

zmiennym powinowactwie wobec

zmiennym powinowactwie wobec

rozdzielanych substancji;

rozdzielanych substancji;



chromatografia jonowymienna

chromatografia jonowymienna

- w

- w

której substancje oddziaływują ze

której substancje oddziaływują ze

złożem za pomocą oddziaływań

złożem za pomocą oddziaływań

jonowych.

jonowych.



TLC

TLC

-

-

cienkowarstwowa

cienkowarstwowa

chromatografia

chromatografia

cieczowa

cieczowa

- technika

- technika

analityczna, lecz

analityczna, lecz

także

także

preparatywna,

preparatywna,

służąca do

służąca do

oczyszczania i

oczyszczania i

identyfikacji

identyfikacji

mieszanin związków

mieszanin związków

chemicznych.

chemicznych.

Chromatogram z
wynikiem rozdziału
barwników atramentu
leżący na walcowatej
komorze
chromatograficznej.

Faza rozdzielcza, złoże, czyli faza

Faza rozdzielcza, złoże, czyli faza

stacjonarna o właściwościach

stacjonarna o właściwościach

sorbcyjnych jest umieszczona jako

sorbcyjnych jest umieszczona jako

cienka (0.01-2 mm) warstwa na płytce

cienka (0.01-2 mm) warstwa na płytce

szklanej, aluminiowej lub z tworzywa

szklanej, aluminiowej lub z tworzywa

sztucznego.

sztucznego.

Substancje rozdzielane nanosi się

punktowo przy dolnej krawędzi płytki,

po czym płytkę umieszcza się w

komorze chromatograficznej

zanurzonej na kilka milimetrów w

eluencie, tak by naniesione substancje

nie zostały zanurzone. Eluent

stopniowo wspina się po płytce dzięki

zjawisku kapilarnemu. Powoduje to

przemieszczanie się rozdzielanych

substancji ku górze.

Prędkość ruchu poszczególnych

składników rozdzielanej mieszaniny
jest zależna od oddiaływań
cząsteczkowych między związkami
chemicznymi obecnymi w analizowanej
próbce, a fazą rozdzielczą i eluentem.
Gdy czoło eluenta dotrze do górnej
krawędzi płytki rozdział jest
zakończony.

Zależnie od swojej natury

fizykochemicznej - składniki
rozdzielanej mieszaniny docierają w
tym czasie na różną wysokość płytki
(współczynnik Rf), a równomierność
rozmieszczenia plam substancji można
charakteryzować ilościowo tzw.
funkcjami

CRF

.

W przypadku, gdy substancje nie są
naturalnie barwne, ich obecność
można stwierdzić używając, zależnie
od ich właściwości, światła UV,
roztworów wywołujących (w których
płytka jest zanurzana lub nimi
spryskiwana - reagują one
specyficznie i barwnie z
rozdzielanymi substancjami) lub
innych metod.

W TLC rozdzielone związki chemiczne

W TLC rozdzielone związki chemiczne

można wydrapać z płytki razem ze

można wydrapać z płytki razem ze

złożem, po czym je odzyskać przez

złożem, po czym je odzyskać przez

ekstrakcję z niego. Technika

ekstrakcję z niego. Technika

stosowana najczęściej w

stosowana najczęściej w

przeparatywnej chromatografii

przeparatywnej chromatografii

cienkowarstwowej.

cienkowarstwowej.

Chromatogram 10
olejków eterycznych.
Położenie związków
na chromatogramie
po jego rozwinięciu
zwizualizowano w
reakcji z wanilią
(reakcja barwna).
Poszczególne związki
można
zidentyfikować nie
tylko na podstawie
położenia (Rf), ale
również koloru w
reakcji wywołującej.