Chromatografia
Chromatografia
-
-
(gr. chromatos = barwa + grapho
(gr. chromatos = barwa + grapho
= pisze) to technika analityczna
= pisze) to technika analityczna
lub preparatywna służąca do
lub preparatywna służąca do
rozdzielania lub badania składu
rozdzielania lub badania składu
mieszanin związków
mieszanin związków
chemicznych.
chemicznych.
W każdej technice chromatograficznej
najpierw rozdziela się badaną
mieszaninę, a następnie przeprowadza
się detekcję (wykrywanie)
poszczególnych składników. Rozdział
substancji następuje w wyniku
przepuszczenia roztworu badanej
mieszaniny przez specjalnie
spreparowaną fazę rozdzielczą (złoże),
zwaną też fazą stacjonarną. Fazą
rozdzielczą są substancje wykazujące
zdolności sorpcyjne lub zdolne do
innych oddziaływań na substancje
przepływające.
Podczas przepływu
(fazy
ruchomej) przez fazę rozdzielczą
następuje proces wymywania
zaadsorbowanych (lub związanych)
substancji. Intensywność tego procesu
jest różna dla poszczególnych
składników mieszaniny. Jedne
składniki są więc zatrzymywane w
fazie dłużej, a inne krócej, dzięki
czemu może następować ich
separacja. Czas przebywania danego
składnika w kolumnie określany jest
mianem
.
W zależności od rodzaju
czyli substancji w której
czyli substancji w której
rozpuszcza się badaną
rozpuszcza się badaną
mieszaninę rozróżnia się
mieszaninę rozróżnia się
następujące techniki
następujące techniki
chromatograficzne:
chromatograficzne:
- w której
- w której
eluentem jest ciekły rozpuszczalnik
eluentem jest ciekły rozpuszczalnik
- w której
- w której
eluentem jest gaz (zwykle wodór lub hel).
eluentem jest gaz (zwykle wodór lub hel).
chromatografia nadkrytyczna
chromatografia nadkrytyczna
- w
- w
której eluentem jest gaz w stanie
której eluentem jest gaz w stanie
nadkrytycznym.
nadkrytycznym.
W zależności od parametrów
W zależności od parametrów
procesu:
procesu:
HPLC
HPLC
- wysokosprawna/ciśnieniowa
- wysokosprawna/ciśnieniowa
chromatografia cieczowa - odmiana
chromatografia cieczowa - odmiana
cieczowej chromatografii kolumnowej z
cieczowej chromatografii kolumnowej z
użyciem eluenta pod wysokim ciśnieniem;
użyciem eluenta pod wysokim ciśnieniem;
FPLC
FPLC
- szybka, białkowa/szybkosprawna
- szybka, białkowa/szybkosprawna
chromatografia cieczowa - odmiana HPLC
chromatografia cieczowa - odmiana HPLC
działająca na niższych ciśnieniach,
działająca na niższych ciśnieniach,
stosująca prócz złóż sorpcyjnych, także
stosująca prócz złóż sorpcyjnych, także
zwykłe złoża typu sit molekularnych,
zwykłe złoża typu sit molekularnych,
służąca głównie do rozdziału białek i
służąca głównie do rozdziału białek i
polipeptydów. Opatentowana i wyłączna
polipeptydów. Opatentowana i wyłączna
nazwa dla firmy Pharmacia.
nazwa dla firmy Pharmacia.
W zależności od rodzaju i
W zależności od rodzaju i
sposobu przygotowania fazy
sposobu przygotowania fazy
rozdzielczej:
rozdzielczej:
chromatografia bibułowa
chromatografia bibułowa
- w której
- w której
fazę rozdzielczą stanowi pasek lub
fazę rozdzielczą stanowi pasek lub
arkusz bibuły filtracyjnej lub specjalnego
arkusz bibuły filtracyjnej lub specjalnego
typu bibuły chromatograficznej;
typu bibuły chromatograficznej;
chromatografia kolumnowa
chromatografia kolumnowa
- w której
- w której
faza rozdzielcza jest umieszczona w
faza rozdzielcza jest umieszczona w
specjalnej kolumnie, przez którą
specjalnej kolumnie, przez którą
przepuszcza się następnie roztwór
przepuszcza się następnie roztwór
badanej mieszaniny. Przepływ roztworu
badanej mieszaniny. Przepływ roztworu
przez kolumnę można wymuszać
przez kolumnę można wymuszać
grawitacyjnie lub stosując różnicę
grawitacyjnie lub stosując różnicę
ciśnień na wlocie i wylocie kolumny;
ciśnień na wlocie i wylocie kolumny;
chromatografia powinowactwa
chromatografia powinowactwa
- w
- w
której odpowiednio spreparowana
której odpowiednio spreparowana
faza rozdzielcza jest zdolna do
faza rozdzielcza jest zdolna do
oddziaływań chemicznych o
oddziaływań chemicznych o
zmiennym powinowactwie wobec
zmiennym powinowactwie wobec
rozdzielanych substancji;
rozdzielanych substancji;
chromatografia jonowymienna
chromatografia jonowymienna
- w
- w
której substancje oddziaływują ze
której substancje oddziaływują ze
złożem za pomocą oddziaływań
złożem za pomocą oddziaływań
jonowych.
jonowych.
TLC
TLC
-
-
cienkowarstwowa
cienkowarstwowa
chromatografia
chromatografia
cieczowa
cieczowa
- technika
- technika
analityczna, lecz
analityczna, lecz
także
także
preparatywna,
preparatywna,
służąca do
służąca do
oczyszczania i
oczyszczania i
identyfikacji
identyfikacji
mieszanin związków
mieszanin związków
chemicznych.
chemicznych.
Chromatogram z
wynikiem rozdziału
barwników atramentu
leżący na walcowatej
komorze
chromatograficznej.
Faza rozdzielcza, złoże, czyli faza
Faza rozdzielcza, złoże, czyli faza
stacjonarna o właściwościach
stacjonarna o właściwościach
sorbcyjnych jest umieszczona jako
sorbcyjnych jest umieszczona jako
cienka (0.01-2 mm) warstwa na płytce
cienka (0.01-2 mm) warstwa na płytce
szklanej, aluminiowej lub z tworzywa
szklanej, aluminiowej lub z tworzywa
sztucznego.
sztucznego.
Substancje rozdzielane nanosi się
punktowo przy dolnej krawędzi płytki,
po czym płytkę umieszcza się w
komorze chromatograficznej
zanurzonej na kilka milimetrów w
eluencie, tak by naniesione substancje
nie zostały zanurzone. Eluent
stopniowo wspina się po płytce dzięki
zjawisku kapilarnemu. Powoduje to
przemieszczanie się rozdzielanych
substancji ku górze.
Prędkość ruchu poszczególnych
składników rozdzielanej mieszaniny
jest zależna od oddiaływań
cząsteczkowych między związkami
chemicznymi obecnymi w analizowanej
próbce, a fazą rozdzielczą i eluentem.
Gdy czoło eluenta dotrze do górnej
krawędzi płytki rozdział jest
zakończony.
Zależnie od swojej natury
fizykochemicznej - składniki
rozdzielanej mieszaniny docierają w
tym czasie na różną wysokość płytki
(współczynnik Rf), a równomierność
rozmieszczenia plam substancji można
charakteryzować ilościowo tzw.
funkcjami
CRF
.
W przypadku, gdy substancje nie są
naturalnie barwne, ich obecność
można stwierdzić używając, zależnie
od ich właściwości, światła UV,
roztworów wywołujących (w których
płytka jest zanurzana lub nimi
spryskiwana - reagują one
specyficznie i barwnie z
rozdzielanymi substancjami) lub
innych metod.
W TLC rozdzielone związki chemiczne
W TLC rozdzielone związki chemiczne
można wydrapać z płytki razem ze
można wydrapać z płytki razem ze
złożem, po czym je odzyskać przez
złożem, po czym je odzyskać przez
ekstrakcję z niego. Technika
ekstrakcję z niego. Technika
stosowana najczęściej w
stosowana najczęściej w
przeparatywnej chromatografii
przeparatywnej chromatografii
cienkowarstwowej.
cienkowarstwowej.
Chromatogram 10
olejków eterycznych.
Położenie związków
na chromatogramie
po jego rozwinięciu
zwizualizowano w
reakcji z wanilią
(reakcja barwna).
Poszczególne związki
można
zidentyfikować nie
tylko na podstawie
położenia (Rf), ale
również koloru w
reakcji wywołującej.