Bartłomiej
Masojć
Bartłomiej
Masojć
Real time PCR
Analiza reakcji PCR w trakcie jej
przebiegu i/lub po jej ukończeniu za
pomocą:
sond molekularnych wyznakowanych
barwnikami fluorescencyjnymi
barwników fluorescencyjnych dsDNA
Real time PCR -
aparatura
termocykler:
blok grzejno-chłodzący
karuzela z próbkami grzana/chłodzona
powietrzem
wzbudzanie fluorescencji
Lampa halogenowa/xenonowa
Laser argonowy
filtry wzbudzenia/emisji
detekcja
Matryca CCD
Fotopowielacz (PMT)
Real time PCR -
aparatura
Real time PCR – skąd zmiany
fluorescencji?
FRET
Static quenching
Łączenie się niektórych barwników z
dsDNA
Real time PCR - FRET
Fluorescence (Förster) Resonance Energy
Transfer
Interakcja pomiędzy dwoma cząsteczkami
fluorescencyjnymi w trakcie której stan
wzbudzenia jest przenoszony z jednej (donora)
na drugą (akcpetor) bez emisji fotonu.
Zależy od odległości pomiędzy cząsteczkami
(10-100A)
Spektrum emisji donora musi się nakładać na
spektrum absorpcji akceptora.
Donor – FAM, Akceptor – CY5, LC Red 610 i 640
Donor – FAM, Akceptor – BHQ, NFQ i inne
Real time PCR - FRET
Real time PCR – static
quenching
contact quenching (kontaktowe „wygaszanie”)
Donor i akceptor w bezpośrednim kontakcie
(bliska odległość)
Większość zaabsorbowanej energii jest
rozpraszana jako ciepło, a nie światło.
Upraszczając:
<10A dominuje contact quenching,
>10A FRET,
wraz z dalszym wzrostem odległości FRET zanika
Real time PCR – barwniki
dsDNA
Połączone z dsDNA świecą ok. 100x
silniej niż bez dsDNA
Różnicują w ten sposób stan
hybrydyzacji komplementarnych nici
DNA (świecą silniej) od denaturacji
(świecą słabiej)
Real time PCR - barwniki
barwniki fluorescencyjne:
FAM (fluoresceina)
JOE
VIC
HEX
ROX
CY3
CY5
inne
wygaszacze (quenchers):
◦
TAMRA
◦
DABCYL
◦
BHQ 1, 2, 3
◦
NFQ
◦
QSY7
◦
Guanina
barwniki dsDNA:
◦
SYBR Green
◦
LC Green I i Plus
◦
SYTO9
◦
EvaGreen
Real time PCR – do
czego?
Analizy ilościowej np. ekspresji genów
Analizy jakościowej – genotypowania
DZIŚ SIĘ SKUPIMY NA GENOTYPOWANIU
Genotypowanie – typy
sond
Hydrolizujące (hydrolysis probes)
TaqMan Probes – SNP Genotyping Assay
Hybrydyzujące (hybridization probes)
Guanine-quenching probe (SimpleProbes)
BHQProbes
Unlabled-Probes (dsDNA dye)
HybProbes
Molecular Beacons
Molecular Scorpions
LUX primers (Guanine-quenching probe)
TaqMan SNP Genotyping
Dwie sondy :
6FAM 5’-NNNNNN
A
NNNNNN-3’ MGB + NFQ
VIC 5’ –NNNNNN
G
NNNNNN-3’ MGB +
NFQ
Dwa specyficzne primery
Aktywność exonukleazy 5’->3’
polimerazy
TaqMan SNP Genotyping
TaqMan SNP Genotyping
A mp lifi c a t io n C u r ve s
Cycles
40
39
38
37
36
35
34
33
32
31
30
29
28
27
26
25
24
23
22
21
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
19.155
17.655
16.155
14.655
13.155
11.655
10.155
8.655
7.155
5.655
4.155
2.655
1.155
TaqMan SNP Genotyping
TaqMan SNP Genotyping
Pre-designed /Validated Assay –
4,5
miliona SNP
Custom TaqMan® SNP Genotyping
Assays
Sami projektujemy – Primer Express
TaqMan SNP Genotyping
Plusy:
szybkość
Uniwersalność
powtarzalność
duża ilość gotowych assayów
prostota
TaqMan SNP Genotyping
Minusy:
W niektórych przypadkach słaba
dyskryminacja alleli
trzy/cztery allele – błędy genotypowania
konieczność normalizacji stężeń DNA
Koszty w stosunku do innych sond
wyższe - ok. 1,1 zł przy zaplanowaniu
eksperymentu na 12,000 reakcji
TaqMan SNP Genotyping
TaqMan SNP Genotyping
TaqMan SNP Genotyping
Bardzo popularne
Można zaryzykować swierdzenie, że
„cały świat na nich pracuje”
Guanine Quenching probes
Guanina posiada właściwości
„wygaszające” fluorescencję
(quenching)
Powtórzenia GG lub GGG lub GGGG
mogą służyć jako quencher
Przyczyna nieznana – contact
quenching?
SimpleProbes (Roche)
Guanine Quenching -
zasada
Badamy polimorfizm A/G
Sonda FAM- 5’
C
nnnnnn
T
nnnnnn3’ –
Pho
Dwa primery – produkt ~ 50 -100 pz
Polimeraza bez aktywności exonukleazy
5’-3’
Asymetryczny PCR
Guanine Quenching -
zasada
denaturacja
FAM- 5’
C
nnnnnn
T
nnnnnn3’ –Pho
3’xxxxxxxxx
GGG
nnnnnn
A
nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’
hybrydyzacja
FAM- 5’
C
nnnnnn
T
nnnnnn3’ –Pho
3’xxxxxxxxx
GGG
nnnnnn
A
nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’
Guanine Quenching -
amplifikacja
Wstępna
denaturacja
Amplifikacj
a 45 – 55
cykli
szybka
denaturacja
szybka
renaturacja
Melting
analysis
Overview
Estimated Time (h:mm:ss)
0:00
10:14
14:28
18:42
22:56
27:10
31:24
35:38
39:52
44:30
54:35
T
em
p
er
at
u
re
(
°C
)
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
Guanine Quenching -
amplifikacja
Tło
(amplifikacja
poniżej
poziomu
detekcji)
Faza
wykładnicz
a
Faza
liniow
a
Faza
nasycen
ia
Guanine Quenching – melting
analysis
hybrydyzacja
SONDA-TARGET
niska
fluorescencja
denaturacja
SONDA-TARGET
flurescencja
rośnie
Pełna
denaturacja
SONDA-TARGET
Fluorescencja
na wyższym
poziomie
Tm 63
0
C
Guanine Quenching -
zasada
full match sonda-target Tm=63
0
C
FAM- 5’
C
nnnnnn
T
nnnnnn3’ –Pho
3’xxxxxxxxx
GGG
nnnnnn
A
nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’
mismatch sonda-target
Tm=56
0
C
FAM- 5’
C
nnnnnn
T
nnnnnn3’ –Pho
3’xxxxxxxxxxxx
GGG
nnnnnn
G
nnnnnnxxxxxxxxxxx 5’
M e lt in g C u r ve s
Temperature (°C)
75
70
65
60
55
50
45
40
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
37.677
36.177
34.677
33.177
31.677
30.177
28.677
27.177
25.677
24.177
22.677
Guanine Quenching -
zasada
hybrydyzacja
SONDA-TARGET
niska
fluorescencja
denaturacja
SONDA-TARGET
flurescencja
rośnie
Pełna
denaturacja
SONDA-TARGET
Fluorescencja
na wyższym
poziomie
Homo AA
Homo GG
Het AG
Kontrola zerowa
M e lt in g C u r ve s
Temperature (°C)
75
70
65
60
55
50
45
40
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
37.677
36.177
34.677
33.177
31.677
30.177
28.677
27.177
25.677
24.177
22.677
Guanine Quenching -
zasada
Homo AA
Homo GG
Het AG
M e l t i n g P e a k s
Temperature (°C)
75
70
65
60
55
50
45
-(
d
/d
T
)
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
0.489
0.189
-0.111
-0.411
-0.711
-1.011
-1.311
-1.611
-1.911
-2.211
-2.511
Kontrola zerowa
Guanine Quenching -
zasada
Homo AA
Homo GG
Het AG
Kontrola zerowa
M e lt in g C u r ve s
Temperature (°C)
75
70
65
60
55
50
45
40
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
37.769
35.769
33.769
31.769
29.769
27.769
25.769
23.769
21.769
19.769
M e l t i n g P e a k s
Temperature (°C)
75
70
65
60
55
50
45
-(
d
/d
T
)
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
0.489
0.189
-0.111
-0.411
-0.711
-1.011
-1.311
-1.611
-1.911
-2.211
-2.511
Guanine Quenching -
projektowanie
Temperatura topnienia sondy: 40-74
0
C
Jeżeli chcemy obserwować amplifikację wtedy Tm sondy > od T annealingu
primerów
Długość sondy >20pz, optymalnie ok. 25 pz
Różnica Tm pomiędzy full matchem i mismatchem ok. 5
0
C
Optymalnie 3 guaniny w targecie, pod FAM
Znakowanie sondy od końca 3’ lub 5’. W tym drugim przypadku
blokowanie dodatkowo grupą fosforanową końca 3’
Projektowanie z użyciem oprogramowania wspomagającego (DINA MELT
Server, MeltCalc)
Amplikon możliwie najkrótszy <100pz
Primery w stosunku 1:10 lub 1:20 - w zależności czy sonda jest Revers czy
Forward tego primera dajemy mniej
Guanine Quenching -
projektowanie
TCACACGCTTCCTCTCCAGagtgatcaagtgtgaccc
G
gtaagtga
ggg
tGATGTCCCAGGCAGCCTTGCC
CCND1 870G>A
Oligoconc. [µM]
0,1
DMSO
[%]
0
Unified parameters
Na eq. [mM]
300
Length [bp]
27
Tm
m
G-5
(5'-
end)
G-5
(3'-
end)
GC[
%]
S1
Smo
d
Sequence (perfect
match)
ctcacttaccgggtcacacttgatcac
69,0
6,8
-5,6
-5,2
51,9 -213,7
-
578,3 -589,8
Sequence (mismatch)
ctcacttactgggtcacacttgatcac
62,2
-5,6
-5,2
48,1 -192,6
-
528,1 -539,6
Reverse sequence (pm)
gtgatcaagtgtgacccggtaagtgag
69,0
3,9
-5,2
-5,6
51,9 -213,7
-
578,3 -589,8
Reverse sequence
(mm)
gtgatcaagtgtgacccagtaagtgag
65,1
-5,2
-5,6
48,1 -202,0
-
550,9 -562,4
Oligoconc. [µM]
0,1
DMSO
[%]
0
Unified parameters
Na eq. [mM]
300
Length [bp]
19
Tm
m
G-5
(5'-
end)
G-5
(3'-
end)
GC[
%]
S1
Smo
d
Sequence (perfect
match)
ctcacttaccgggtcacac
61,5
10,9
-5,6
-6,0
57,9 -149,0
-
402,5 -410,5
Sequence (mismatch)
ctcacttactgggtcacac
50,6
-5,6
-6,0
52,6 -127,9
-
352,3 -360,3
Reverse sequence (pm)
gtgtgacccggtaagtgag
61,5
6,1
-6,0
-5,6
57,9 -149,0
-
402,5 -410,5
Reverse sequence
(mm)
gtgtgacccagtaagtgag
55,4
-6,0
-5,6
52,6 -137,3
-
375,1 -383,1
MeltCalc
Guanine Quenching -
projektowanie
CCND1 870G>A
Sonda 27pz
Sonda
27pz
Sonda
19pz
DINAMELT
Guanine Quenching – jaka
sonda?
Homo AA
Homo GG
Het AG
Kontrola zerowa
Me lting C urve s
Temperature (°C)
74
72
70
68
66
64
62
60
58
56
54
52
50
48
46
44
42
40
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
37.833
36.933
36.033
35.133
34.233
33.333
32.433
31.533
30.633
29.733
28.833
Me lting C urves
Temperature (°C)
74
72
70
68
66
64
62
60
58
56
54
52
50
48
46
44
42
40
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
29.577
28.877
28.177
27.477
26.777
26.077
25.377
24.677
23.977
23.277
22.577
M e lt in g P e a k s
Temperature (°C)
74
72
70
68
66
64
62
60
58
56
54
52
50
48
46
44
42
-(
d
/d
T
)
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
0.326
0.256
0.186
0.116
0.046
-0.024
-0.094
-0.164
-0.234
-0.304
-0.374
Me lt in g P e a k s
Temperature (°C)
74
72
70
68
66
64
62
60
58
56
54
52
50
48
46
44
42
-(
d
/d
T
)
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
0.292
0.192
0.092
-0.008
-0.108
-0.208
-0.308
-0.408
-0.508
-0.608
-0.708
-0.808
Sonda
27pz
Sonda
19pz
Rzeczywiste wyniki
Guanine Quenching – asymetryczny
PCR
Homo AA
Homo GG
Kontrola zerowa
Kontrola zerowa
F:R = 1:1
F:R = 1:5
Po co asymetryczny?
•Aby namnożyć jak najwięcej
matrycy dla sondy i zmniejszyć
konkurencję nici
komplementarnej powstającej z
drugiego primera.
•Dzięki temu zwiększamy
stosunek S/N
Guanine Quenching – asymetryczny
PCR
Homo AA
Homo GG
Kontrola zerowa
A mp lifi c a t io n C u r ve s
Cycles
54
52
50
48
46
44
42
40
38
36
34
32
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
0.461
-0.239
-0.939
-1.639
-2.339
-3.039
-3.739
-4.439
ZASADA:
Sonda Forward – primera Forward
mniej
Sonda Revers - primera Revers
mniej
Kontrola zerowa
F:R = 1:1
F:R = 1:5
F:R = 1:20
BHQ probes - zasada
Badamy polimorfizm A/G
Sonda1 FAM- 5’nnnnnn
T
nnnnnn3’ –Pho
Sonda2 5’ – nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn3’ –
BHQ1
Dwa primery – produkt ~ 50 -100 pz
Polimeraza bez aktywności exonukleazy
5’-3’
Asymetryczny PCR
BHQ probes -zasada
denaturacja
5’ – nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn3’ – BHQ1
FAM- 5’nnnnnn
T
nnnnnn3’ –Pho
3’xxxxxxxxxnnnnnnnnn
A
nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’
hybrydyzacja
5’ – nnnnnnnnnnnnn
nnnnnn
T
nnnnnn 3 ’ –Pho
3’xxxnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
A
nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’
FAM
BHQ1
BHQ probes- amplifikacja
Tło
(amplifikacja
poniżej
poziomu
detekcji)
Faza
wykładnicz
a
Faza
liniow
a
Faza
nasycen
ia
BHQ Probes - zasada
Homo AA
Homo GG
Het AG
Kontrola zerowa
BHQ Probes - projektowanie
Temperatura topnienia sondy FAM: 40-74
0
C
Temperatura topnienia sondy BHQ wyższa o 5
0
C od sondy FAM
Jeżeli chcemy obserwować amplifikację wtedy Tm sond > od T annealingu
primerów
Długość sondy >20pz, optymalnie ok. 25 pz
Różnica Tm pomiędzy full matchem i mismatchem ok. 5
0
C
Znakowanie sondy FAM od końca i blokowanie dodatkowo grupą
fosforanową końca 3’
Znakowanie sondy BHQ na 3’
Odległość pomiędzi sondą 1 i 2 – od 0 - 5 pz
Projektowanie z użyciem oprogramowania wspomagającego (DINA MELT
Server, MeltCalc)
Amplikon możliwie najkrótszy <100pz
Primery w stosunku 1:10 lub 1:20 - w zależności czy sonda jest Revers czy
Forward tego primera dajemy mniej
CAGTGCAAGGCCTGAACCTGAGgagccccaacaacttcctgtcctac
tacc
gcctcacacgcttcctctccag
a
gtgatcaagtgtgaccc
G
gtaagtgag
ggtg
atgtcccaggcagccttgccggggcttacagggGGAGACACCTAGTGCCACGGAA
BHQ Probes - projektowanie
CCND1 870G>A
MeltCalc
FAM
BHQ1
Oligoconc. [µM]
0,1
DMSO
[%]
0
Unified
parameters
Na eq. [mM]
300
Length [bp]
27
Tm
m
G-5
(5'-
end)
G-5
(3'-
end)
GC[
%]
S1
Smo
d
Sequence (perfect
match)
GTGATCAAGTGTGACCCaGTAAGTGAG
67,2
5,0
-5,2
-5,6
48,1
-
211,4
-
574,
9
-
586,4
Sequence
(mismatch)
GTGATCAAGTGTGACCCgGTAAGTGAG
62,2
-5,2
-5,6
51,9
-
192,6
-
528,
1
-
539,6
Reverse sequence
(pm)
ctcacttactgggtcacacttgatcac
67,2
2,1
-5,6
-5,2
48,1
-
211,4
-
574,
9
-
586,4
Reverse sequence
(mm)
ctcacttaccgggtcacacttgatcac
65,1
-5,6
-5,2
51,9
-
202,0
-
550,
9
-
562,4
Oligoconc. [µM]
0,1
DMSO
[%]
0
Unified
parameters
Na eq. [mM]
300
Length [bp]
22
Tm
m
G-5
(5'-
end)
G-5
(3'-
end)
GC[
%]
S1
Smo
d
Sequence (perfect
match)
GCCTCACACGCTTCCTCTCCAG
69,1
0,0
-6,8
-6,0
63,6
-
176,0
-
470,
2
-
479,5
Sequence
(mismatch)
GCCTCACACGCTTCCTCTCCAG
69,1
-6,8
-6,0
63,6
-
176,0
-
470,
2
-
479,5
Reverse sequence
(pm)
ctggagaggaagcgtgtgaggc
69,1
0,0
-6,0
-6,8
63,6
-
176,0
-
470,
2
-
479,5
Reverse sequence
(mm)
ctggagaggaagcgtgtgaggc
69,1
-6,0
-6,8
63,6
-
176,0
-
470,
2
-
479,5
BHQ Probes - projektowanie
CCND1 870G>A
BHQ
Sonda
DINAMelt
BHQ probe – rzeczywiste wyniki
Homo AA
Homo GG
Het AG
Kontrola zerowa
Rzeczywiste wyniki
Homo AA
Homo GG
Het AG
Kontrola zerowa
A mp lifi c a t io n C u r ve s
Cycles
41
40
39
38
37
36
35
34
33
32
31
30
29
28
27
26
25
24
23
22
21
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
0.106
-0.294
-0.694
-1.094
-1.494
-1.894
-2.294
-2.694
-3.094
BHQ Probes– asymetryczny PCR
Kontrola zerowa
ZASADA:
Sondy Forward – primera Forward
mniej
Sondy Revers - primera Revers
mniej
F:R = 1:1
F:R = 1:5
F:R = 1:20
F:R = 1:10
F:R = 1:40
M e lt i n g P e a k s
Temperature (°C)
80
75
70
65
60
55
50
45
-(
d
/d
T
)
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
0.131
0.031
-0.069
-0.169
-0.269
-0.369
-0.469
-0.569
-0.669
-0.769
-0.869
BHQ Probes– asymetryczny PCR
Kontrola zerowa
ZASADA:
Sondy Forward – primera Forward
mniej
Sondy Revers - primera Revers
mniej
F:R = 1:1
F:R = 1:5
F:R = 1:20
F:R = 1:10
LUNAProbes –
sondy
nieznakowane
Badamy polimorfizm A/G
Sonda nieznakowane
Sonda 5’nnnnnn
T
nnnnnn3’ –Pho
Dwa primery – produkt ~ 50 -100 pz
SYTO9, LC GREEN, Eva GREEN
Polimeraza bez aktywności exonukleazy
5’-3’
Asymetryczny PCR
SYTO9
SYTO9
hybrydyzacja
5’ –nnnnnn
T
nnnnnn 3 ’ –Pho
3’xxxnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
A
nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’
denaturacja
5’nnnnnn
T
nnnnnn3’ –Pho
3’xxxxxxxxxnnnnnnnnn
A
nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’
LUNA probes -zasada
SYTO
9
SYTO
9
SYTO
9
A mp lifi c a t io n C u r ve s
Cycles
40
39
38
37
36
35
34
33
32
31
30
29
28
27
26
25
24
23
22
21
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
F
lu
o
re
sc
en
ce
(
48
3-
53
3)
32.504
29.504
26.504
23.504
20.504
17.504
14.504
11.504
8.504
5.504
2.504
-0.496
LUNAProbes- amplifikacja
LUNAProbes - zasada
Homo AA
Homo GG
Het AG
Kontrola zerowa
BHQ Probes - projektowanie
Temperatura topnienia sondy FAM: 40-74
0
C
Jeżeli chcemy obserwować amplifikację wtedy Tm sond > od T annealingu
primerów
Długość sondy >20pz, optymalnie ok. 25 pz
Różnica Tm pomiędzy full matchem i mismatchem ok. 5
0
C
Blokowanie dodatkowo grupą fosforanową końca 3’
Projektowanie z użyciem oprogramowania wspomagającego (DINA MELT
Server, MeltCalc)
Amplikon możliwie najkrótszy <100pz
Primery w stosunku 1:10 lub 1:20 - w zależności czy sonda jest Revers czy
Forward tego primera dajemy mniej
CAGTGCAAGGCCTGAACCTGAGgagccccaacaacttcctgtcctac
tacc
gcctcacacgcttcctctccag
a
gtgatcaagtgtgaccc
G
gtaagtgag
ggtg
atgtcccaggcagccttgccggggcttacagggGGAGACACCTAGTGCCACGGAA
BHQ Probes - projektowanie
CCND1 870G>A
MeltCalc
FAM
BHQ1
Oligoconc. [µM]
0,1
DMSO
[%]
0
Unified
parameters
Na eq. [mM]
300
Length [bp]
27
Tm
m
G-5
(5'-
end)
G-5
(3'-
end)
GC[
%]
S1
Smo
d
Sequence (perfect
match)
GTGATCAAGTGTGACCCaGTAAGTGAG
67,2
5,0
-5,2
-5,6
48,1
-
211,4
-
574,
9
-
586,4
Sequence
(mismatch)
GTGATCAAGTGTGACCCgGTAAGTGAG
62,2
-5,2
-5,6
51,9
-
192,6
-
528,
1
-
539,6
Reverse sequence
(pm)
ctcacttactgggtcacacttgatcac
67,2
2,1
-5,6
-5,2
48,1
-
211,4
-
574,
9
-
586,4
Reverse sequence
(mm)
ctcacttaccgggtcacacttgatcac
65,1
-5,6
-5,2
51,9
-
202,0
-
550,
9
-
562,4
Oligoconc. [µM]
0,1
DMSO
[%]
0
Unified
parameters
Na eq. [mM]
300
Length [bp]
22
Tm
m
G-5
(5'-
end)
G-5
(3'-
end)
GC[
%]
S1
Smo
d
Sequence (perfect
match)
GCCTCACACGCTTCCTCTCCAG
69,1
0,0
-6,8
-6,0
63,6
-
176,0
-
470,
2
-
479,5
Sequence
(mismatch)
GCCTCACACGCTTCCTCTCCAG
69,1
-6,8
-6,0
63,6
-
176,0
-
470,
2
-
479,5
Reverse sequence
(pm)
ctggagaggaagcgtgtgaggc
69,1
0,0
-6,0
-6,8
63,6
-
176,0
-
470,
2
-
479,5
Reverse sequence
(mm)
ctggagaggaagcgtgtgaggc
69,1
-6,0
-6,8
63,6
-
176,0
-
470,
2
-
479,5
BHQ Probes - projektowanie
CCND1 870G>A
BHQ
Sonda
DINAMelt
Co wybrać?
Jeżeli nie lubimy się zastanawiać nad
metodyką, zależy nam na czasie i mamy
fundusze : TaqMan (1,1 zł/próbkę)
Jeżeli lubimy główkować , mamy trochę
więcej czasu i mniej funduszy:
SimpleProbes –40 gr/próbke
BHQ Probes – lepszy S/N w porównaniu do
SimpleProbes (ok. 45-50 gr/próbke)
LUNAProbes - < 40gr/próbkę