REAL TIME PCR genotypowanie

background image

Bartłomiej
Masojć

background image

Real time PCR

Analiza reakcji PCR w trakcie jej
przebiegu i/lub po jej ukończeniu za
pomocą:

sond molekularnych wyznakowanych
barwnikami fluorescencyjnymi

barwników fluorescencyjnych dsDNA

background image

Real time PCR -
aparatura

termocykler:

blok grzejno-chłodzący

karuzela z próbkami grzana/chłodzona

powietrzem

wzbudzanie fluorescencji

Lampa halogenowa/xenonowa

Laser argonowy

filtry wzbudzenia/emisji

detekcja

Matryca CCD

Fotopowielacz (PMT)

background image

Real time PCR -
aparatura

background image

Real time PCR – skąd zmiany

fluorescencji?

FRET

Static quenching

Łączenie się niektórych barwników z
dsDNA

background image

Real time PCR - FRET

Fluorescence (Förster) Resonance Energy

Transfer

Interakcja pomiędzy dwoma cząsteczkami

fluorescencyjnymi w trakcie której stan

wzbudzenia jest przenoszony z jednej (donora)

na drugą (akcpetor) bez emisji fotonu.

Zależy od odległości pomiędzy cząsteczkami

(10-100A)

Spektrum emisji donora musi się nakładać na

spektrum absorpcji akceptora.

Donor – FAM, Akceptor – CY5, LC Red 610 i 640

Donor – FAM, Akceptor – BHQ, NFQ i inne

background image

Real time PCR - FRET

background image

Real time PCR – static
quenching

contact quenching (kontaktowe „wygaszanie”)

Donor i akceptor w bezpośrednim kontakcie

(bliska odległość)

Większość zaabsorbowanej energii jest

rozpraszana jako ciepło, a nie światło.

Upraszczając:

<10A dominuje contact quenching,

>10A FRET,

wraz z dalszym wzrostem odległości FRET zanika

background image

Real time PCR – barwniki
dsDNA

Połączone z dsDNA świecą ok. 100x
silniej niż bez dsDNA

Różnicują w ten sposób stan
hybrydyzacji komplementarnych nici
DNA (świecą silniej) od denaturacji
(świecą słabiej)

background image

Real time PCR - barwniki

barwniki fluorescencyjne:

FAM (fluoresceina)

JOE

VIC

HEX

ROX

CY3

CY5

inne

wygaszacze (quenchers):

TAMRA

DABCYL

BHQ 1, 2, 3

NFQ

QSY7

Guanina

barwniki dsDNA:

SYBR Green

LC Green I i Plus

SYTO9

EvaGreen

background image

Real time PCR – do
czego?

Analizy ilościowej np. ekspresji genów

Analizy jakościowej – genotypowania

DZIŚ SIĘ SKUPIMY NA GENOTYPOWANIU

background image

Genotypowanie – typy
sond

Hydrolizujące (hydrolysis probes)

TaqMan Probes – SNP Genotyping Assay

Hybrydyzujące (hybridization probes)

Guanine-quenching probe (SimpleProbes)

BHQProbes

Unlabled-Probes (dsDNA dye)

HybProbes

Molecular Beacons

Molecular Scorpions

LUX primers (Guanine-quenching probe)

background image

TaqMan SNP Genotyping

Dwie sondy :

6FAM 5’-NNNNNN

A

NNNNNN-3’ MGB + NFQ

VIC 5’ –NNNNNN

G

NNNNNN-3’ MGB +

NFQ

Dwa specyficzne primery

Aktywność exonukleazy 5’->3’
polimerazy

background image

TaqMan SNP Genotyping

background image

TaqMan SNP Genotyping

A mp lifi c a t io n C u r ve s

Cycles

40

39

38

37

36

35

34

33

32

31

30

29

28

27

26

25

24

23

22

21

20

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

19.155

17.655

16.155

14.655

13.155

11.655

10.155

8.655

7.155

5.655

4.155

2.655

1.155

background image

TaqMan SNP Genotyping

background image

TaqMan SNP Genotyping

Pre-designed /Validated Assay –

4,5

miliona SNP

Custom TaqMan® SNP Genotyping
Assays

Sami projektujemy – Primer Express

background image

TaqMan SNP Genotyping

Plusy:

szybkość

Uniwersalność

powtarzalność

duża ilość gotowych assayów

prostota

background image

TaqMan SNP Genotyping

Minusy:

W niektórych przypadkach słaba
dyskryminacja alleli

trzy/cztery allele – błędy genotypowania

konieczność normalizacji stężeń DNA

Koszty w stosunku do innych sond
wyższe - ok. 1,1 zł przy zaplanowaniu
eksperymentu na 12,000 reakcji

background image

TaqMan SNP Genotyping

background image

TaqMan SNP Genotyping

background image

TaqMan SNP Genotyping

Bardzo popularne

Można zaryzykować swierdzenie, że
„cały świat na nich pracuje”

background image

Guanine Quenching probes

Guanina posiada właściwości
„wygaszające” fluorescencję
(quenching)

Powtórzenia GG lub GGG lub GGGG
mogą służyć jako quencher

Przyczyna nieznana – contact
quenching?

SimpleProbes (Roche)

background image

Guanine Quenching -
zasada

Badamy polimorfizm A/G

Sonda FAM- 5’

C

nnnnnn

T

nnnnnn3’ –

Pho

Dwa primery – produkt ~ 50 -100 pz

Polimeraza bez aktywności exonukleazy
5’-3’

Asymetryczny PCR

background image

Guanine Quenching -
zasada

denaturacja

FAM- 5’

C

nnnnnn

T

nnnnnn3’ –Pho

3’xxxxxxxxx

GGG

nnnnnn

A

nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’

hybrydyzacja

FAM- 5’

C

nnnnnn

T

nnnnnn3’ –Pho

3’xxxxxxxxx

GGG

nnnnnn

A

nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’

background image

Guanine Quenching -
amplifikacja

Wstępna

denaturacja

Amplifikacj

a 45 – 55

cykli

szybka

denaturacja

szybka

renaturacja

Melting

analysis

Overview

Estimated Time (h:mm:ss)

0:00

10:14

14:28

18:42

22:56

27:10

31:24

35:38

39:52

44:30

54:35

T

em

p

er

at

u

re

(

°C

)

100

95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30

background image

Guanine Quenching -
amplifikacja

Tło

(amplifikacja

poniżej

poziomu

detekcji)

Faza

wykładnicz

a

Faza

liniow

a

Faza

nasycen

ia

background image

Guanine Quenching – melting
analysis

hybrydyzacja

SONDA-TARGET

niska

fluorescencja

denaturacja

SONDA-TARGET

flurescencja

rośnie

Pełna

denaturacja

SONDA-TARGET

Fluorescencja

na wyższym

poziomie

Tm 63

0

C

background image

Guanine Quenching -
zasada

full match sonda-target Tm=63

0

C

FAM- 5’

C

nnnnnn

T

nnnnnn3’ –Pho

3’xxxxxxxxx

GGG

nnnnnn

A

nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’

mismatch sonda-target

Tm=56

0

C

FAM- 5’

C

nnnnnn

T

nnnnnn3’ –Pho

3’xxxxxxxxxxxx

GGG

nnnnnn

G

nnnnnnxxxxxxxxxxx 5’

background image

M e lt in g C u r ve s

Temperature (°C)

75

70

65

60

55

50

45

40

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

37.677
36.177
34.677
33.177
31.677
30.177
28.677
27.177
25.677
24.177
22.677

Guanine Quenching -
zasada

hybrydyzacja

SONDA-TARGET

niska

fluorescencja

denaturacja

SONDA-TARGET

flurescencja

rośnie

Pełna

denaturacja

SONDA-TARGET

Fluorescencja

na wyższym

poziomie

Homo AA

Homo GG

Het AG

Kontrola zerowa

background image

M e lt in g C u r ve s

Temperature (°C)

75

70

65

60

55

50

45

40

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

37.677
36.177
34.677
33.177
31.677
30.177
28.677
27.177
25.677
24.177
22.677

Guanine Quenching -
zasada

Homo AA

Homo GG

Het AG

M e l t i n g P e a k s

Temperature (°C)

75

70

65

60

55

50

45

-(

d

/d

T

)

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

0.489

0.189

-0.111

-0.411

-0.711

-1.011

-1.311

-1.611

-1.911

-2.211

-2.511

Kontrola zerowa

background image

Guanine Quenching -
zasada

Homo AA

Homo GG

Het AG

Kontrola zerowa

M e lt in g C u r ve s

Temperature (°C)

75

70

65

60

55

50

45

40

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

37.769
35.769
33.769
31.769
29.769
27.769
25.769
23.769
21.769
19.769

M e l t i n g P e a k s

Temperature (°C)

75

70

65

60

55

50

45

-(

d

/d

T

)

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

0.489

0.189

-0.111

-0.411

-0.711

-1.011

-1.311

-1.611

-1.911

-2.211

-2.511

background image

Guanine Quenching -
projektowanie

Temperatura topnienia sondy: 40-74

0

C

Jeżeli chcemy obserwować amplifikację wtedy Tm sondy > od T annealingu
primerów

Długość sondy >20pz, optymalnie ok. 25 pz

Różnica Tm pomiędzy full matchem i mismatchem ok. 5

0

C

Optymalnie 3 guaniny w targecie, pod FAM

Znakowanie sondy od końca 3’ lub 5’. W tym drugim przypadku
blokowanie dodatkowo grupą fosforanową końca 3’

Projektowanie z użyciem oprogramowania wspomagającego (DINA MELT
Server, MeltCalc)

Amplikon możliwie najkrótszy <100pz

Primery w stosunku 1:10 lub 1:20 - w zależności czy sonda jest Revers czy
Forward tego primera dajemy mniej

background image

Guanine Quenching -
projektowanie

TCACACGCTTCCTCTCCAGagtgatcaagtgtgaccc

G

gtaagtga

ggg

tGATGTCCCAGGCAGCCTTGCC

CCND1 870G>A

Oligoconc. [µM]

0,1

DMSO
[%]

0

Unified parameters

 

Na eq. [mM]

300

Length [bp]

27

Tm

m

G-5

(5'-

end)

G-5

(3'-

end)

GC[

%]



S1

Smo

d

Sequence (perfect

match)

ctcacttaccgggtcacacttgatcac

69,0

6,8

-5,6

-5,2

51,9 -213,7

-

578,3 -589,8

Sequence (mismatch)

ctcacttactgggtcacacttgatcac

62,2

 

-5,6

-5,2

48,1 -192,6

-

528,1 -539,6

Reverse sequence (pm)

gtgatcaagtgtgacccggtaagtgag

69,0

3,9

-5,2

-5,6

51,9 -213,7

-

578,3 -589,8

Reverse sequence

(mm)

gtgatcaagtgtgacccagtaagtgag

65,1

-5,2

-5,6

48,1 -202,0

-

550,9 -562,4

Oligoconc. [µM]

0,1

DMSO

[%]

0

Unified parameters

 

Na eq. [mM]

300

Length [bp]

19

Tm

m

G-5

(5'-

end)

G-5

(3'-

end)

GC[

%]



S1

Smo

d

Sequence (perfect

match)

ctcacttaccgggtcacac

61,5

10,9

-5,6

-6,0

57,9 -149,0

-

402,5 -410,5

Sequence (mismatch)

ctcacttactgggtcacac

50,6

 

-5,6

-6,0

52,6 -127,9

-

352,3 -360,3

Reverse sequence (pm)

gtgtgacccggtaagtgag

61,5

6,1

-6,0

-5,6

57,9 -149,0

-

402,5 -410,5

Reverse sequence

(mm)

gtgtgacccagtaagtgag

55,4

-6,0

-5,6

52,6 -137,3

-

375,1 -383,1

MeltCalc

background image

Guanine Quenching -
projektowanie

CCND1 870G>A

Sonda 27pz

Sonda
27pz

Sonda
19pz

DINAMELT

background image

Guanine Quenching – jaka
sonda?

Homo AA

Homo GG

Het AG

Kontrola zerowa

Me lting C urve s

Temperature (°C)

74

72

70

68

66

64

62

60

58

56

54

52

50

48

46

44

42

40

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

37.833
36.933
36.033
35.133
34.233
33.333
32.433
31.533
30.633
29.733
28.833

Me lting C urves

Temperature (°C)

74

72

70

68

66

64

62

60

58

56

54

52

50

48

46

44

42

40

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

29.577
28.877
28.177
27.477
26.777
26.077
25.377
24.677
23.977
23.277
22.577

M e lt in g P e a k s

Temperature (°C)

74

72

70

68

66

64

62

60

58

56

54

52

50

48

46

44

42

-(

d

/d

T

)

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

0.326

0.256

0.186

0.116

0.046

-0.024

-0.094

-0.164

-0.234

-0.304

-0.374

Me lt in g P e a k s

Temperature (°C)

74

72

70

68

66

64

62

60

58

56

54

52

50

48

46

44

42

-(

d

/d

T

)

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

0.292

0.192

0.092

-0.008

-0.108

-0.208

-0.308

-0.408

-0.508

-0.608

-0.708

-0.808

Sonda
27pz

Sonda
19pz

Rzeczywiste wyniki

background image

Guanine Quenching – asymetryczny
PCR

Homo AA

Homo GG

Kontrola zerowa

Kontrola zerowa

F:R = 1:1

F:R = 1:5

Po co asymetryczny?

•Aby namnożyć jak najwięcej
matrycy dla sondy i zmniejszyć
konkurencję nici
komplementarnej powstającej z
drugiego primera.

•Dzięki temu zwiększamy
stosunek S/N

background image

Guanine Quenching – asymetryczny
PCR

Homo AA

Homo GG

Kontrola zerowa

A mp lifi c a t io n C u r ve s

Cycles

54

52

50

48

46

44

42

40

38

36

34

32

30

28

26

24

22

20

18

16

14

12

10

8

6

4

2

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

0.461

-0.239

-0.939

-1.639

-2.339

-3.039

-3.739

-4.439

ZASADA:

Sonda Forward – primera Forward

mniej

Sonda Revers - primera Revers

mniej

Kontrola zerowa

F:R = 1:1

F:R = 1:5

F:R = 1:20

background image

BHQ probes - zasada

Badamy polimorfizm A/G

Sonda1 FAM- 5’nnnnnn

T

nnnnnn3’ –Pho

Sonda2 5’ – nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn3’ –
BHQ1

Dwa primery – produkt ~ 50 -100 pz

Polimeraza bez aktywności exonukleazy
5’-3’

Asymetryczny PCR

background image

BHQ probes -zasada

denaturacja

5’ – nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn3’ – BHQ1

FAM- 5’nnnnnn

T

nnnnnn3’ –Pho

3’xxxxxxxxxnnnnnnnnn

A

nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’

hybrydyzacja

5’ – nnnnnnnnnnnnn

nnnnnn

T

nnnnnn 3 ’ –Pho

3’xxxnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

A

nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’

FAM

BHQ1

background image

BHQ probes- amplifikacja

Tło

(amplifikacja

poniżej

poziomu

detekcji)

Faza

wykładnicz

a

Faza

liniow

a

Faza

nasycen

ia

background image

BHQ Probes - zasada

Homo AA

Homo GG

Het AG

Kontrola zerowa

background image

BHQ Probes - projektowanie

Temperatura topnienia sondy FAM: 40-74

0

C

Temperatura topnienia sondy BHQ wyższa o 5

0

C od sondy FAM

Jeżeli chcemy obserwować amplifikację wtedy Tm sond > od T annealingu
primerów

Długość sondy >20pz, optymalnie ok. 25 pz

Różnica Tm pomiędzy full matchem i mismatchem ok. 5

0

C

Znakowanie sondy FAM od końca i blokowanie dodatkowo grupą
fosforanową końca 3’

Znakowanie sondy BHQ na 3’

Odległość pomiędzi sondą 1 i 2 – od 0 - 5 pz

Projektowanie z użyciem oprogramowania wspomagającego (DINA MELT
Server, MeltCalc)

Amplikon możliwie najkrótszy <100pz

Primery w stosunku 1:10 lub 1:20 - w zależności czy sonda jest Revers czy
Forward tego primera dajemy mniej

background image

CAGTGCAAGGCCTGAACCTGAGgagccccaacaacttcctgtcctac

tacc

gcctcacacgcttcctctccag

a

gtgatcaagtgtgaccc

G

gtaagtgag

ggtg

atgtcccaggcagccttgccggggcttacagggGGAGACACCTAGTGCCACGGAA

BHQ Probes - projektowanie

CCND1 870G>A

MeltCalc

FAM

BHQ1

Oligoconc. [µM]

0,1

DMSO

[%]

0

Unified
parameters

 

Na eq. [mM]

300

Length [bp]

27

Tm

m

G-5

(5'-

end)

G-5

(3'-

end)

GC[

%]



S1 

Smo

d

Sequence (perfect
match)

GTGATCAAGTGTGACCCaGTAAGTGAG

67,2

5,0

-5,2

-5,6

48,1

-

211,4

-

574,

9

-

586,4

Sequence
(mismatch)

GTGATCAAGTGTGACCCgGTAAGTGAG

62,2

 

-5,2

-5,6

51,9

-

192,6

-

528,

1

-

539,6

Reverse sequence
(pm)

ctcacttactgggtcacacttgatcac

67,2

2,1

-5,6

-5,2

48,1

-

211,4

-

574,

9

-

586,4

Reverse sequence
(mm)

ctcacttaccgggtcacacttgatcac

65,1

-5,6

-5,2

51,9

-

202,0

-

550,

9

-

562,4

Oligoconc. [µM]

0,1

DMSO

[%]

0

Unified
parameters

 

Na eq. [mM]

300

Length [bp]

22

Tm

m

G-5

(5'-

end)

G-5

(3'-

end)

GC[

%]



S1 

Smo

d

Sequence (perfect

match)

GCCTCACACGCTTCCTCTCCAG

69,1

0,0

-6,8

-6,0

63,6

-

176,0

-

470,

2

-

479,5

Sequence

(mismatch)

GCCTCACACGCTTCCTCTCCAG

69,1

 

-6,8

-6,0

63,6

-

176,0

-

470,

2

-

479,5

Reverse sequence

(pm)

ctggagaggaagcgtgtgaggc

69,1

0,0

-6,0

-6,8

63,6

-

176,0

-

470,

2

-

479,5

Reverse sequence

(mm)

ctggagaggaagcgtgtgaggc

69,1

-6,0

-6,8

63,6

-

176,0

-

470,

2

-

479,5

background image

BHQ Probes - projektowanie

CCND1 870G>A

BHQ

Sonda

DINAMelt

background image

BHQ probe – rzeczywiste wyniki

Homo AA

Homo GG

Het AG

Kontrola zerowa

Rzeczywiste wyniki

Homo AA

Homo GG

Het AG

Kontrola zerowa

background image

A mp lifi c a t io n C u r ve s

Cycles

41

40

39

38

37

36

35

34

33

32

31

30

29

28

27

26

25

24

23

22

21

20

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

0.106

-0.294

-0.694

-1.094

-1.494

-1.894

-2.294

-2.694

-3.094

BHQ Probes– asymetryczny PCR

Kontrola zerowa

ZASADA:

Sondy Forward – primera Forward

mniej

Sondy Revers - primera Revers

mniej

F:R = 1:1

F:R = 1:5

F:R = 1:20

F:R = 1:10

F:R = 1:40

background image

M e lt i n g P e a k s

Temperature (°C)

80

75

70

65

60

55

50

45

-(

d

/d

T

)

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

0.131

0.031

-0.069

-0.169

-0.269

-0.369

-0.469

-0.569

-0.669

-0.769

-0.869

BHQ Probes– asymetryczny PCR

Kontrola zerowa

ZASADA:

Sondy Forward – primera Forward

mniej

Sondy Revers - primera Revers

mniej

F:R = 1:1

F:R = 1:5

F:R = 1:20

F:R = 1:10

background image

LUNAProbes –

sondy

nieznakowane

Badamy polimorfizm A/G

Sonda nieznakowane

Sonda 5’nnnnnn

T

nnnnnn3’ –Pho

Dwa primery – produkt ~ 50 -100 pz

SYTO9, LC GREEN, Eva GREEN

Polimeraza bez aktywności exonukleazy
5’-3’

Asymetryczny PCR

background image

SYTO9

SYTO9

hybrydyzacja

5’ –nnnnnn

T

nnnnnn 3 ’ –Pho

3’xxxnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn

A

nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’

denaturacja

5’nnnnnn

T

nnnnnn3’ –Pho

3’xxxxxxxxxnnnnnnnnn

A

nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’

LUNA probes -zasada

SYTO

9

SYTO

9

SYTO

9

background image

A mp lifi c a t io n C u r ve s

Cycles

40

39

38

37

36

35

34

33

32

31

30

29

28

27

26

25

24

23

22

21

20

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

32.504

29.504

26.504

23.504

20.504

17.504

14.504

11.504

8.504

5.504

2.504

-0.496

LUNAProbes- amplifikacja

background image

LUNAProbes - zasada

Homo AA

Homo GG

Het AG

Kontrola zerowa

background image

BHQ Probes - projektowanie

Temperatura topnienia sondy FAM: 40-74

0

C

Jeżeli chcemy obserwować amplifikację wtedy Tm sond > od T annealingu
primerów

Długość sondy >20pz, optymalnie ok. 25 pz

Różnica Tm pomiędzy full matchem i mismatchem ok. 5

0

C

Blokowanie dodatkowo grupą fosforanową końca 3’

Projektowanie z użyciem oprogramowania wspomagającego (DINA MELT
Server, MeltCalc)

Amplikon możliwie najkrótszy <100pz

Primery w stosunku 1:10 lub 1:20 - w zależności czy sonda jest Revers czy
Forward tego primera dajemy mniej

background image

CAGTGCAAGGCCTGAACCTGAGgagccccaacaacttcctgtcctac

tacc

gcctcacacgcttcctctccag

a

gtgatcaagtgtgaccc

G

gtaagtgag

ggtg

atgtcccaggcagccttgccggggcttacagggGGAGACACCTAGTGCCACGGAA

BHQ Probes - projektowanie

CCND1 870G>A

MeltCalc

FAM

BHQ1

Oligoconc. [µM]

0,1

DMSO

[%]

0

Unified
parameters

 

Na eq. [mM]

300

Length [bp]

27

Tm

m

G-5

(5'-

end)

G-5

(3'-

end)

GC[

%]



S1 

Smo

d

Sequence (perfect
match)

GTGATCAAGTGTGACCCaGTAAGTGAG

67,2

5,0

-5,2

-5,6

48,1

-

211,4

-

574,

9

-

586,4

Sequence
(mismatch)

GTGATCAAGTGTGACCCgGTAAGTGAG

62,2

 

-5,2

-5,6

51,9

-

192,6

-

528,

1

-

539,6

Reverse sequence
(pm)

ctcacttactgggtcacacttgatcac

67,2

2,1

-5,6

-5,2

48,1

-

211,4

-

574,

9

-

586,4

Reverse sequence
(mm)

ctcacttaccgggtcacacttgatcac

65,1

-5,6

-5,2

51,9

-

202,0

-

550,

9

-

562,4

Oligoconc. [µM]

0,1

DMSO

[%]

0

Unified
parameters

 

Na eq. [mM]

300

Length [bp]

22

Tm

m

G-5

(5'-

end)

G-5

(3'-

end)

GC[

%]



S1 

Smo

d

Sequence (perfect

match)

GCCTCACACGCTTCCTCTCCAG

69,1

0,0

-6,8

-6,0

63,6

-

176,0

-

470,

2

-

479,5

Sequence

(mismatch)

GCCTCACACGCTTCCTCTCCAG

69,1

 

-6,8

-6,0

63,6

-

176,0

-

470,

2

-

479,5

Reverse sequence

(pm)

ctggagaggaagcgtgtgaggc

69,1

0,0

-6,0

-6,8

63,6

-

176,0

-

470,

2

-

479,5

Reverse sequence

(mm)

ctggagaggaagcgtgtgaggc

69,1

-6,0

-6,8

63,6

-

176,0

-

470,

2

-

479,5

background image

BHQ Probes - projektowanie

CCND1 870G>A

BHQ

Sonda

DINAMelt

background image

Co wybrać?

Jeżeli nie lubimy się zastanawiać nad

metodyką, zależy nam na czasie i mamy

fundusze : TaqMan (1,1 zł/próbkę)

Jeżeli lubimy główkować , mamy trochę

więcej czasu i mniej funduszy:

SimpleProbes –40 gr/próbke

BHQ Probes – lepszy S/N w porównaniu do

SimpleProbes (ok. 45-50 gr/próbke)

LUNAProbes - < 40gr/próbkę


Document Outline


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Real time pcr, pomoce naukowe, biotechnologia
REAL TIME PCR czarus1
Podstawy techniki real time PCR
Odwrotne transkryptazy, real time PCR
2002%20 %20June%20 %209USMVS%20real%20time
REAL TIME
Embedded Linux Ready For Real Time Montavista
Continuous real time data protection and disaster recovery
2002%20 %20June%20 %209USMVS%20real%20time
Zero hour, Real time Computer Virus Defense through Collaborative Filtering
Revealing the Form and Function of Self Injurious Thoughts and Behaviours A Real Time Ecological As
A Model for Detecting the Existence of Unknown Computer Viruses in Real Time
Facebook tworzenie aplikacji real time updates
[Filmmaking Technique] The virtual cinematographer a paradigm for automatic real time camera contr
2001 12 Real Time Os with a Pre Emptive Kernel

więcej podobnych podstron