TERAPIA GENOWA
TERAPIA GENOWA
TERAPIA GENOWA
TERAPIA GENOWA
Terapia genowa -
Terapia genowa -
genoterapia
genoterapia
Może być nowoczesnym sposobem
Może być nowoczesnym sposobem
leczenia wrodzonych błędów
leczenia wrodzonych błędów
genetycznych oraz niektórych
genetycznych oraz niektórych
ciężkich chorób nabytych, takich jak
ciężkich chorób nabytych, takich jak
nowotwory lub AIDS, w których
nowotwory lub AIDS, w których
dotychczas stosowane metody
dotychczas stosowane metody
leczenia konwencjonalnego nie
leczenia konwencjonalnego nie
przyniosły zadawalających
przyniosły zadawalających
rezultatów
rezultatów
STRATEGIE TERAPII
STRATEGIE TERAPII
GENOWEJ
GENOWEJ
Transfer genu
Transfer genu
ex vivo
ex vivo
pobranie od chorego komórek docelowych i
pobranie od chorego komórek docelowych i
wprowadzenie
wprowadzenie
ex vivo
ex vivo
in vitro
in vitro
terapeutycznego
terapeutycznego
genu
genu
wprowadzenie tak zmodyfikowanych komórek z
wprowadzenie tak zmodyfikowanych komórek z
powrotem do organizmu chorego
powrotem do organizmu chorego
Transfer genu
Transfer genu
in vivo
in vivo
wprowadzenie terapeutycznego genu za pomocą
wprowadzenie terapeutycznego genu za pomocą
wektora bezpośrednio do komórek (tkanek)
wektora bezpośrednio do komórek (tkanek)
chorego, bez pobierania komórek docelowych
chorego, bez pobierania komórek docelowych
RODZAJE TERAPII
RODZAJE TERAPII
GENOWEJ
GENOWEJ
Dodawanie genów (ang.
Dodawanie genów (ang.
gene addition therapy
gene addition therapy
)
)
gen uszkodzony pozostaje w swoim
gen uszkodzony pozostaje w swoim
locus
locus
, a gen
, a gen
terapeutyczny jest wprowadzany w inne miejsce
terapeutyczny jest wprowadzany w inne miejsce
chromosomu
chromosomu
Zamiana genów (ang.
Zamiana genów (ang.
gene replacement
gene replacement
therapy
therapy
)
)
polega na wymianie genu zmutowanego na gen
polega na wymianie genu zmutowanego na gen
prawidłowy w procesie tzw. somatycznej
prawidłowy w procesie tzw. somatycznej
rekombinacji homologicznej
rekombinacji homologicznej
„
„
Doskonalenie” genomu (ang.
Doskonalenie” genomu (ang.
gene
gene
augmentation therapy
augmentation therapy
)
)
dodanie genu, który nie zastępuje funkcji
dodanie genu, który nie zastępuje funkcji
żadnego genu, ale koduje substancje, które
żadnego genu, ale koduje substancje, które
fizjologicznie nie są produkowane przez
fizjologicznie nie są produkowane przez
modyfikowaną komórkę
modyfikowaną komórkę
mogą to być:
mogą to być:
rybozymy
rybozymy
oligonukleotydy antysensowne
oligonukleotydy antysensowne
białka wirusowe (np. kinaza tymidynowa
białka wirusowe (np. kinaza tymidynowa
wirusa
wirusa
Herpes simplex
Herpes simplex
)
)
Il-2
Il-2
METODY
METODY
WPROWADZANIA GENÓW
WPROWADZANIA GENÓW
DO KOMÓREK
DO KOMÓREK
Metody biologiczne
Metody biologiczne
wektory wirusów RNA – retrowirusy
wektory wirusów RNA – retrowirusy
wektory wirusów DNA – adenowirusy
wektory wirusów DNA – adenowirusy
Metody fizyko-chemiczne
Metody fizyko-chemiczne
fuzja DNA z liposomami
fuzja DNA z liposomami
transfekcja precypitatu DNA z fosforanem
transfekcja precypitatu DNA z fosforanem
wapnia
wapnia
elektroporacja
elektroporacja
mikroiniekcja dojądrowa
mikroiniekcja dojądrowa
WARUNKI IDEALNEJ
WARUNKI IDEALNEJ
METODY TRANSFERU
METODY TRANSFERU
GENÓW
GENÓW
Powinna być na tyle wydajna, aby każda
Powinna być na tyle wydajna, aby każda
komórka otrzymywała tę samą, ściśle określoną
komórka otrzymywała tę samą, ściśle określoną
dawkę genów.
dawkę genów.
Powinna być prosta, umożliwiająca dostarczenie
Powinna być prosta, umożliwiająca dostarczenie
materiału genetycznego w jednym tylko
materiału genetycznego w jednym tylko
podaniu.
podaniu.
Transfer genu powinien dotrzeć tylko do tych
Transfer genu powinien dotrzeć tylko do tych
miejsc w organizmie, w których jest wymagany.
miejsc w organizmie, w których jest wymagany.
Integracja „terapeutycznego” DNA powinna się
Integracja „terapeutycznego” DNA powinna się
odbyć na drodze rekombinacji homologicznej
odbyć na drodze rekombinacji homologicznej
(wzajemnej wymianie genu „terapeutycznego” z
(wzajemnej wymianie genu „terapeutycznego” z
genem uszkodzonym).
genem uszkodzonym).
NAJCZĘŚCIEJ
NAJCZĘŚCIEJ
STOSOWANE WEKTORY
STOSOWANE WEKTORY
W GENOTERAPII
W GENOTERAPII
RETROWIRUSY
RETROWIRUSY
76
76
71,7%
71,7%
ADENOWIRUSY
ADENOWIRUSY
15
15
14,2%
14,2%
KATIONOWE LIPOSOMY
KATIONOWE LIPOSOMY
12
12
11,3%
11,3%
PLAZMIDY DNA
PLAZMIDY DNA
2
2
1,9%
1,9%
ADENO-ASSOCIATED
ADENO-ASSOCIATED
VIRUSES
VIRUSES
1
1
0,9%
0,9%
106
106
100,0
100,0
%
%
(
(
S.H. Orkin, A.G. Motulsky, 1995; NIH
S.H. Orkin, A.G. Motulsky, 1995; NIH
USA
USA
)
)
WEKTORY WIRUSOWE
WEKTORY WIRUSOWE
RETROWIRUSY – wirusy RNA
RETROWIRUSY – wirusy RNA
W celu utworzenia wektora usuwa się sekwencje
W celu utworzenia wektora usuwa się sekwencje
gag
gag
– pol – env
– pol – env
, z wyjątkiem sekwencji promotorowych
, z wyjątkiem sekwencji promotorowych
LTR (ang.
LTR (ang.
Long Terminal Repeats
Long Terminal Repeats
),
),
odpowiedzialnych za integrację wirusa, replikację i
odpowiedzialnych za integrację wirusa, replikację i
transkrypcję.
transkrypcję.
Transfekcja DNA za pomocą wektora
Transfekcja DNA za pomocą wektora
retrowirusowego dotyczy komórek dzielących się.
retrowirusowego dotyczy komórek dzielących się.
Zalety:
Zalety:
zdolność do stabilnej transdukcji prawie
zdolność do stabilnej transdukcji prawie
100%
100%
komórek docelowych, niewielka
komórek docelowych, niewielka
immunogenność
immunogenność
Wady:
Wady:
możliwość powstania mutacji w komórce
możliwość powstania mutacji w komórce
gospodarza
gospodarza
ADENOWIRUSY – wirusy DNA
ADENOWIRUSY – wirusy DNA
Uniemożliwienie autoreplikacji osiąga się
Uniemożliwienie autoreplikacji osiąga się
przez usunięcie z genomu wirusa regionu E1.
przez usunięcie z genomu wirusa regionu E1.
Transfekcja DNA za pomocą wektora
Transfekcja DNA za pomocą wektora
adenowirusowego dotyczy również komórek w
adenowirusowego dotyczy również komórek w
fazie G0 cyklu komórkowego.
fazie G0 cyklu komórkowego.
Zalety:
Zalety:
nie integrują z genomem gospodarza
nie integrują z genomem gospodarza
– wirusowe
– wirusowe
DNA funkcjonuje w postaci
DNA funkcjonuje w postaci
nietrwałego episomu
nietrwałego episomu
(pozachromosomowo), znaczna pojemność –
(pozachromosomowo), znaczna pojemność –
do 36 kb DNA
do 36 kb DNA
Wady:
Wady:
wysoka immunogenność
wysoka immunogenność
WEKTORY CHEMICZNE
WEKTORY CHEMICZNE
LIPOSOMY
LIPOSOMY
– cząsteczki lipidów o charakterze
– cząsteczki lipidów o charakterze
kationowym zawierające egzogenny DNA
kationowym zawierające egzogenny DNA
Charakterystyka:
Charakterystyka:
duża pojemność, niska
duża pojemność, niska
immunogenność,
immunogenność,
nietoksyczność, wektor –
nietoksyczność, wektor –
plazmid
plazmid
W terapii
W terapii
in vivo
in vivo
kationowe liposomy wnikają na drodze
kationowe liposomy wnikają na drodze
endocytozy głównie do makrofagów,
endocytozy głównie do makrofagów,
liposomy tzw. „niewidzialne” (ang.
liposomy tzw. „niewidzialne” (ang.
stealth
stealth
) dla
) dla
makrofagów (np. w kompleksie z gangliozydem
makrofagów (np. w kompleksie z gangliozydem
GM1)
GM1)
Modyfikacje liposomów – wielkość, ładunek
Modyfikacje liposomów – wielkość, ładunek
elektryczny, ligandy powierzchniowe
elektryczny, ligandy powierzchniowe
PIERWSZA TERAPIA
PIERWSZA TERAPIA
GENOWA
GENOWA
14.09.1990 R. (M. Blaese, S. Rosenberg, W.F.
14.09.1990 R. (M. Blaese, S. Rosenberg, W.F.
Anderson)
Anderson)
Pacjentka – czteroletnia dziewczynka Ashanthi De
Pacjentka – czteroletnia dziewczynka Ashanthi De
Silva
Silva
Ciężki złożony niedobór odporności
Ciężki złożony niedobór odporności
(ang.
(ang.
Severe
Severe
Combined Immunodeficiency -
Combined Immunodeficiency -
SCID)
SCID)
Charakterystyka SCID:
Charakterystyka SCID:
brak enzymu deaminazy adenozyny (ADA)
brak enzymu deaminazy adenozyny (ADA)
cecha autosomalna recesywna
cecha autosomalna recesywna
selektywna toksyczność metabolitów adenozyny w
selektywna toksyczność metabolitów adenozyny w
stosunku do limfocytów T
stosunku do limfocytów T
ciężkie oportunistyczne zakażenia
ciężkie oportunistyczne zakażenia
wysoka śmiertelność
wysoka śmiertelność
Transfer genu
Transfer genu
ADA
ADA
do limfocytów.
do limfocytów.
PODSTAWOWE STRATEGIE
PODSTAWOWE STRATEGIE
ZASTOSOWANIA TERAPII
ZASTOSOWANIA TERAPII
GENOWEJ W
GENOWEJ W
NOWOTWORACH
NOWOTWORACH
Kompensacja mutacji onkogenów i genów
Kompensacja mutacji onkogenów i genów
supresorowych
supresorowych
(ang.
(ang.
mutation compensation
mutation compensation
)
)
Molekularna chemioterapia
Molekularna chemioterapia
(ang.
(ang.
molecular
molecular
chemotherapy
chemotherapy
)
)
Genetyczne wzmocnienie odpowiedzi
Genetyczne wzmocnienie odpowiedzi
immunologicznej
immunologicznej
(ang.
(ang.
genetic
genetic
immunopotentation
immunopotentation
)
)
NAJCZĘŚCIEJ STOSOWANE
NAJCZĘŚCIEJ STOSOWANE
STRATEGIE TERAPII
STRATEGIE TERAPII
GENOWEJ W
GENOWEJ W
NOWOTWORACH
NOWOTWORACH
Immunoterapia (
Immunoterapia (
ex vivo
ex vivo
)
)
23
23
45,1%
45,1%
Pro-lek (HSV-Tk/gancyklovir)
Pro-lek (HSV-Tk/gancyklovir)
11
11
21,7%
21,7%
Immunoterapia (
Immunoterapia (
in vivo
in vivo
)
)
7
7
13,7%
13,7%
Chemioprotekcja
Chemioprotekcja
4
4
7,8%
7,8%
Wprowadzanie genów
Wprowadzanie genów
supresorowych
supresorowych
4
4
7,8%
7,8%
Antysensowne nukleotydy
Antysensowne nukleotydy
2
2
3,9%
3,9%
51
51
100,
100,
%
%
(
(
S.H. Orkin, A.G. Motulsky, 1995; NIH
S.H. Orkin, A.G. Motulsky, 1995; NIH
USA
USA
)
)
KOMPENSACJA MUTACJI
KOMPENSACJA MUTACJI
Inhibicja funkcji onkogenu:
Inhibicja funkcji onkogenu:
a)
a)
zatrzymanie procesu transkrypcji określonego
zatrzymanie procesu transkrypcji określonego
onkogenu – zastosowanie antysensownych
onkogenu – zastosowanie antysensownych
oligonukleotydów tworzących strukturę potrójnej
oligonukleotydów tworzących strukturę potrójnej
helisy (tzw. DNA tripleksowy)
helisy (tzw. DNA tripleksowy)
b)
b)
zatrzymanie procesu translacji na matrycy mRNA
zatrzymanie procesu translacji na matrycy mRNA
określonego onkogenu – zastosowanie
określonego onkogenu – zastosowanie
antysensownego oligonukleotydu, który hybrydyzuje
antysensownego oligonukleotydu, który hybrydyzuje
z kodującymi sekwencjami mRNA onkogenu (np.
z kodującymi sekwencjami mRNA onkogenu (np.
oligonukleotyd komplementarny do
oligonukleotyd komplementarny do
K-Ras
K-Ras
mRNA)
mRNA)
c)
c)
zablokowanie funkcji onkoprotein w komórkach
zablokowanie funkcji onkoprotein w komórkach
docelowych – przez wykorzystanie
docelowych – przez wykorzystanie
„wewnątrzkomórkowych przeciwciał”, które blokują
„wewnątrzkomórkowych przeciwciał”, które blokują
działanie onkoprotein
działanie onkoprotein
Zastąpienie form zmutowanych genów
Zastąpienie form zmutowanych genów
supresorowych np. p53, RB1 (RB1 –
supresorowych np. p53, RB1 (RB1 –
retinoblastoma) formą niezmutowaną
retinoblastoma) formą niezmutowaną
(dziką) tych genów.
(dziką) tych genów.
STRATEGIE KOMPENSACJI
STRATEGIE KOMPENSACJI
MUTACJI
MUTACJI
*
*
Gen
Gen
Strategi
Strategi
a
a
Wektor
Wektor
Typ guza
Typ guza
p53
p53
zastąpie
zastąpie
nie genu
nie genu
adenowir
adenowir
us
us
rak „nie-
rak „nie-
drobnokomórkowy
drobnokomórkowy
” płuca, rak sutka,
” płuca, rak sutka,
rak prostaty,
rak prostaty,
przerzuty do
przerzuty do
wątroby raka jelita
wątroby raka jelita
grubego
grubego
RB
RB
zastąpie
zastąpie
nie genu
nie genu
adenowir
adenowir
us
us
rak pęcherza
rak pęcherza
BRCA-
BRCA-
1
1
zastąpie
zastąpie
nie genu
nie genu
retrowiru
retrowiru
s
s
rak jajnika
rak jajnika
Gen
Gen
Strateg
Strateg
ia
ia
Wektor
Wektor
Typ guza
Typ guza
K-Ras
K-Ras
antysen
antysen
s
s
retrowiru
retrowiru
s
s
rak „nie-
rak „nie-
drobnokomórkowy
drobnokomórkowy
” płuca
” płuca
c-myc
c-myc
c-fos
c-fos
antysen
antysen
s
s
retrowiru
retrowiru
s
s
rak sutka, rak
rak sutka, rak
prostaty
prostaty
IGF-1
IGF-1
antysen
antysen
s
s
kationow
kationow
e
e
liposomy
liposomy
glejaki
glejaki
*(
*(
Gomez-Navarro i wsp., Eur. J. Cancer, 1999,
Gomez-Navarro i wsp., Eur. J. Cancer, 1999,
867-885
867-885
)
)
MOLEKULARNA
MOLEKULARNA
CHEMIOTERAPIA
CHEMIOTERAPIA
Podawanie genów toksyn
Podawanie genów toksyn
Np. podawanie enzymów aktywujących
Np. podawanie enzymów aktywujących
prekursory leków, gen kinazy
prekursory leków, gen kinazy
tymidynowej wirusa HPV (
tymidynowej wirusa HPV (
HSV-tk
HSV-tk
)
)
Tego typu terapii genowej sprzyja tzw.
Tego typu terapii genowej sprzyja tzw.
efekt „sąsiedztwa” (ang.
efekt „sąsiedztwa” (ang.
bystander
bystander
effect
effect
)
)
Np. gen deaminazy cytozyny
Np. gen deaminazy cytozyny
5’-fluorocytozyna
5’-fluorocytozyna
5’-fluorouracyl
5’-fluorouracyl
Podawanie genów oporności na leki
Podawanie genów oporności na leki
Cel:
Cel:
ochrona komórek normalnych – głównie
ochrona komórek normalnych – głównie
macierzystych przed działaniem dużych
macierzystych przed działaniem dużych
dawek chemioterapeutyków
dawek chemioterapeutyków
Wykorzystuje się geny rodziny oporności
Wykorzystuje się geny rodziny oporności
wielolekowej (ang.
wielolekowej (ang.
multi drug resistant,
multi drug resistant,
MDR
MDR
)
)
Produkty tych genów (
Produkty tych genów (
MDR
MDR
) odgrywają
) odgrywają
rolę aktywnych transporterów związków
rolę aktywnych transporterów związków
cytotoksycznych, obniżając ich rzeczywiste
cytotoksycznych, obniżając ich rzeczywiste
stężenie w komórce.
stężenie w komórce.
Podawanie genów usprawniających
Podawanie genów usprawniających
wpływ konwencjonalnego leczenia
wpływ konwencjonalnego leczenia
antynowotworowego
antynowotworowego
Cel:
Cel:
uwrażliwienie komórek nowotworowych
uwrażliwienie komórek nowotworowych
na chemio- i radioterpię
na chemio- i radioterpię
Np. transfer genu cytochromu
Np. transfer genu cytochromu
wątrobowego P450 powoduje przemianę
wątrobowego P450 powoduje przemianę
cyklofosfamidu do 4-
cyklofosfamidu do 4-
hydroksycyklofosfamidu (rak sutka)
hydroksycyklofosfamidu (rak sutka)
Indukowanie apoptozy, np.
Indukowanie apoptozy, np.
włączenie do komórek genu
włączenie do komórek genu
p53
p53
,
,
wyłączenie funkcji genu
wyłączenie funkcji genu
bcl-2
bcl-2
GENETYCZNA MODYFIKACJA
GENETYCZNA MODYFIKACJA
KOMÓREK NOWOTWOROWYCH W
KOMÓREK NOWOTWOROWYCH W
CELU ZWIĘKSZENIA ICH
CELU ZWIĘKSZENIA ICH
IMMUNOGENNOŚCI
IMMUNOGENNOŚCI
Podawanie odpowiednio spreparowanych
Podawanie odpowiednio spreparowanych
(napromienionych) autologicznych lub
(napromienionych) autologicznych lub
allogenicznych komórek nowotworowych w
allogenicznych komórek nowotworowych w
połączeniu z adiuwantami np. z BCG.
połączeniu z adiuwantami np. z BCG.
Podawanie komórek prezentujących antygeny
Podawanie komórek prezentujących antygeny
MHC, np. komórek dendrytycznych
MHC, np. komórek dendrytycznych
preinkubowanych z antygenami nowotworowymi.
preinkubowanych z antygenami nowotworowymi.
Wprowadzenie genów dla układu MHC, np. HLA-
Wprowadzenie genów dla układu MHC, np. HLA-
B7 do komórek czerniaka.
B7 do komórek czerniaka.
Wprowadzenie do komórek nowotworowych
Wprowadzenie do komórek nowotworowych
genów dla antygenów nowotworowych, np. genu
genów dla antygenów nowotworowych, np. genu
dla antygenu MART-1 czerniaka.
dla antygenu MART-1 czerniaka.
Wprowadzenie do komórek nowotworowych
Wprowadzenie do komórek nowotworowych
genów dla cytokin, np. dla Il
genów dla cytokin, np. dla Il
-2, IFN-
-2, IFN-
,
,
czynnika GM-CFS
czynnika GM-CFS
*
*
.
.
Wprowadzenie do komórek nowotworowych
Wprowadzenie do komórek nowotworowych
genów dla cząstek B7.1 (CD80).
genów dla cząstek B7.1 (CD80).
*
*
GM-CFS – czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i
GM-CFS – czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i
makrofagów
makrofagów
GENETYCZNA MODYFIKACJA
GENETYCZNA MODYFIKACJA
IMMUNOLOGICZNYCH
IMMUNOLOGICZNYCH
KOMÓREK EFEKTOROWYCH
KOMÓREK EFEKTOROWYCH
Swoista immunoterapia komórkowa
Swoista immunoterapia komórkowa
Komórki TIL (ang.
Komórki TIL (ang.
Tumor Infiltrating
Tumor Infiltrating
Lymphocytes
Lymphocytes
) – heterogenna populacja
) – heterogenna populacja
limfocytów T o właściwościach
limfocytów T o właściwościach
cytotoksycznych w stosunku do
cytotoksycznych w stosunku do
autologicznych lub allogenicznych
autologicznych lub allogenicznych
komórek nowotworowych.
komórek nowotworowych.
Komórki
TIL
bezpośredni efekt
cytotoksyczny
wprowadzenie
genów dla np. Il-2,
TNF-
IMMUNOTERAPIA BIERNA
IMMUNOTERAPIA BIERNA
NOWOTWORÓW
NOWOTWORÓW
PRZECIWCIAŁAMI
PRZECIWCIAŁAMI
MONOKLONALNYMI
MONOKLONALNYMI
Przeciwciała monoklonalne
Przeciwciała monoklonalne
tradycyjne
tradycyjne
, np. blokujące receptory na
, np. blokujące receptory na
komórkach nowotworowych.
komórkach nowotworowych.
połączone z radioizotopami
połączone z radioizotopami
, np. jodem
, np. jodem
radioaktywnym (
radioaktywnym (
131
131
I)
I)
połączone z enzymami
połączone z enzymami
np. w metodzie
np. w metodzie
„przeciwciało-enzym-prolek”.
„przeciwciało-enzym-prolek”.
o podwójnej swoistości
o podwójnej swoistości
:
:
swoiste do komórki efektorowej (np. limfocytu
swoiste do komórki efektorowej (np. limfocytu
T – anty-CD3)
T – anty-CD3)
swoiste do komórki docelowej (antygenu
swoiste do komórki docelowej (antygenu
związanego z nowotworem)
związanego z nowotworem)
METODY IMMUNOTERAPII
METODY IMMUNOTERAPII
NIESWOISTEJ
NIESWOISTEJ
Podawanie preparatów immunostymulujących
Podawanie preparatów immunostymulujących
(bakteryjnych, np. BCG, syntetycznych, np.
(bakteryjnych, np. BCG, syntetycznych, np.
lewamizol)
lewamizol)
Imunoterapia cytokinami, np.:
Imunoterapia cytokinami, np.:
IFN- - białaczka włochatokomórkowa, rak
nerki
Il-2
- rak nerki, czerniaki
Łączenie cytokin, np.:
Łączenie cytokin, np.:
Il-2 z
Il-2 z
IFN-
IFN-
TNF- z
z
z
IFN-
IFN-
- mięsaki
- mięsaki