TERAPIA GENOWA

TERAPIA GENOWA

Terapia genowa -

Terapia genowa -

genoterapia

genoterapia



Może być nowoczesnym sposobem

Może być nowoczesnym sposobem

leczenia wrodzonych błędów

leczenia wrodzonych błędów

genetycznych oraz niektórych

genetycznych oraz niektórych

ciężkich chorób nabytych, takich jak

ciężkich chorób nabytych, takich jak

nowotwory lub AIDS, w których

nowotwory lub AIDS, w których

dotychczas stosowane metody

dotychczas stosowane metody

leczenia konwencjonalnego nie

leczenia konwencjonalnego nie

przyniosły zadawalających

przyniosły zadawalających

rezultatów

rezultatów

STRATEGIE TERAPII

STRATEGIE TERAPII

GENOWEJ

GENOWEJ



Transfer genu

Transfer genu

ex vivo

ex vivo



pobranie od chorego komórek docelowych i

pobranie od chorego komórek docelowych i

wprowadzenie

wprowadzenie

ex vivo

ex vivo

in vitro

in vitro

terapeutycznego

terapeutycznego

genu

genu



wprowadzenie tak zmodyfikowanych komórek z

wprowadzenie tak zmodyfikowanych komórek z

powrotem do organizmu chorego

powrotem do organizmu chorego



Transfer genu

Transfer genu

in vivo

in vivo



wprowadzenie terapeutycznego genu za pomocą

wprowadzenie terapeutycznego genu za pomocą

wektora bezpośrednio do komórek (tkanek)

wektora bezpośrednio do komórek (tkanek)

chorego, bez pobierania komórek docelowych

chorego, bez pobierania komórek docelowych

RODZAJE TERAPII

RODZAJE TERAPII

GENOWEJ

GENOWEJ



Dodawanie genów (ang.

Dodawanie genów (ang.

gene addition therapy

gene addition therapy

)

)

gen uszkodzony pozostaje w swoim

gen uszkodzony pozostaje w swoim

locus

locus

, a gen

, a gen

terapeutyczny jest wprowadzany w inne miejsce

terapeutyczny jest wprowadzany w inne miejsce

chromosomu

chromosomu



Zamiana genów (ang.

Zamiana genów (ang.

gene replacement

gene replacement

therapy

therapy

)

)

polega na wymianie genu zmutowanego na gen

polega na wymianie genu zmutowanego na gen

prawidłowy w procesie tzw. somatycznej

prawidłowy w procesie tzw. somatycznej

rekombinacji homologicznej

rekombinacji homologicznej



„

„

Doskonalenie” genomu (ang.

Doskonalenie” genomu (ang.

gene

gene

augmentation therapy

augmentation therapy

)

)

dodanie genu, który nie zastępuje funkcji

dodanie genu, który nie zastępuje funkcji

żadnego genu, ale koduje substancje, które

żadnego genu, ale koduje substancje, które

fizjologicznie nie są produkowane przez

fizjologicznie nie są produkowane przez

modyfikowaną komórkę

modyfikowaną komórkę

mogą to być:

mogą to być:



rybozymy

rybozymy



oligonukleotydy antysensowne

oligonukleotydy antysensowne



białka wirusowe (np. kinaza tymidynowa

białka wirusowe (np. kinaza tymidynowa

wirusa

wirusa

Herpes simplex

Herpes simplex

)

)



Il-2

Il-2

METODY

METODY

WPROWADZANIA GENÓW

WPROWADZANIA GENÓW

DO KOMÓREK

DO KOMÓREK



Metody biologiczne

Metody biologiczne



wektory wirusów RNA – retrowirusy

wektory wirusów RNA – retrowirusy



wektory wirusów DNA – adenowirusy

wektory wirusów DNA – adenowirusy



Metody fizyko-chemiczne

Metody fizyko-chemiczne



fuzja DNA z liposomami

fuzja DNA z liposomami



transfekcja precypitatu DNA z fosforanem

transfekcja precypitatu DNA z fosforanem

wapnia

wapnia



elektroporacja

elektroporacja



mikroiniekcja dojądrowa

mikroiniekcja dojądrowa

WARUNKI IDEALNEJ

WARUNKI IDEALNEJ

METODY TRANSFERU

METODY TRANSFERU

GENÓW

GENÓW



Powinna być na tyle wydajna, aby każda

Powinna być na tyle wydajna, aby każda

komórka otrzymywała tę samą, ściśle określoną

komórka otrzymywała tę samą, ściśle określoną

dawkę genów.

dawkę genów.



Powinna być prosta, umożliwiająca dostarczenie

Powinna być prosta, umożliwiająca dostarczenie

materiału genetycznego w jednym tylko

materiału genetycznego w jednym tylko

podaniu.

podaniu.



Transfer genu powinien dotrzeć tylko do tych

Transfer genu powinien dotrzeć tylko do tych

miejsc w organizmie, w których jest wymagany.

miejsc w organizmie, w których jest wymagany.



Integracja „terapeutycznego” DNA powinna się

Integracja „terapeutycznego” DNA powinna się

odbyć na drodze rekombinacji homologicznej

odbyć na drodze rekombinacji homologicznej

(wzajemnej wymianie genu „terapeutycznego” z

(wzajemnej wymianie genu „terapeutycznego” z

genem uszkodzonym).

genem uszkodzonym).

NAJCZĘŚCIEJ

NAJCZĘŚCIEJ

STOSOWANE WEKTORY

STOSOWANE WEKTORY

W GENOTERAPII

W GENOTERAPII

RETROWIRUSY

RETROWIRUSY

76

76

71,7%

71,7%

ADENOWIRUSY

ADENOWIRUSY

15

15

14,2%

14,2%

KATIONOWE LIPOSOMY

KATIONOWE LIPOSOMY

12

12

11,3%

11,3%

PLAZMIDY DNA

PLAZMIDY DNA

2

2

1,9%

1,9%

ADENO-ASSOCIATED

ADENO-ASSOCIATED

VIRUSES

VIRUSES

1

1

0,9%

0,9%

106

106

100,0

100,0

%

%

(

(

S.H. Orkin, A.G. Motulsky, 1995; NIH

S.H. Orkin, A.G. Motulsky, 1995; NIH

USA

USA

)

)

WEKTORY WIRUSOWE

WEKTORY WIRUSOWE



RETROWIRUSY – wirusy RNA

RETROWIRUSY – wirusy RNA

W celu utworzenia wektora usuwa się sekwencje

W celu utworzenia wektora usuwa się sekwencje

gag

gag

– pol – env

– pol – env

, z wyjątkiem sekwencji promotorowych

, z wyjątkiem sekwencji promotorowych

LTR (ang.

LTR (ang.

Long Terminal Repeats

Long Terminal Repeats

),

),

odpowiedzialnych za integrację wirusa, replikację i

odpowiedzialnych za integrację wirusa, replikację i

transkrypcję.

transkrypcję.

Transfekcja DNA za pomocą wektora

Transfekcja DNA za pomocą wektora

retrowirusowego dotyczy komórek dzielących się.

retrowirusowego dotyczy komórek dzielących się.

Zalety:

Zalety:

zdolność do stabilnej transdukcji prawie

zdolność do stabilnej transdukcji prawie

100%

100%

komórek docelowych, niewielka

komórek docelowych, niewielka

immunogenność

immunogenność

Wady:

Wady:

możliwość powstania mutacji w komórce

możliwość powstania mutacji w komórce

gospodarza

gospodarza



ADENOWIRUSY – wirusy DNA

ADENOWIRUSY – wirusy DNA

Uniemożliwienie autoreplikacji osiąga się

Uniemożliwienie autoreplikacji osiąga się

przez usunięcie z genomu wirusa regionu E1.

przez usunięcie z genomu wirusa regionu E1.

Transfekcja DNA za pomocą wektora

Transfekcja DNA za pomocą wektora

adenowirusowego dotyczy również komórek w

adenowirusowego dotyczy również komórek w

fazie G0 cyklu komórkowego.

fazie G0 cyklu komórkowego.

Zalety:

Zalety:

nie integrują z genomem gospodarza

nie integrują z genomem gospodarza

– wirusowe

– wirusowe

DNA funkcjonuje w postaci

DNA funkcjonuje w postaci

nietrwałego episomu

nietrwałego episomu

(pozachromosomowo), znaczna pojemność –

(pozachromosomowo), znaczna pojemność –

do 36 kb DNA

do 36 kb DNA

Wady:

Wady:

wysoka immunogenność

wysoka immunogenność

WEKTORY CHEMICZNE

WEKTORY CHEMICZNE



LIPOSOMY

LIPOSOMY

– cząsteczki lipidów o charakterze

– cząsteczki lipidów o charakterze

kationowym zawierające egzogenny DNA

kationowym zawierające egzogenny DNA

Charakterystyka:

Charakterystyka:

duża pojemność, niska

duża pojemność, niska

immunogenność,

immunogenność,

nietoksyczność, wektor –

nietoksyczność, wektor –

plazmid

plazmid

W terapii

W terapii

in vivo

in vivo



kationowe liposomy wnikają na drodze

kationowe liposomy wnikają na drodze

endocytozy głównie do makrofagów,

endocytozy głównie do makrofagów,



liposomy tzw. „niewidzialne” (ang.

liposomy tzw. „niewidzialne” (ang.

stealth

stealth

) dla

) dla

makrofagów (np. w kompleksie z gangliozydem

makrofagów (np. w kompleksie z gangliozydem

GM1)

GM1)

Modyfikacje liposomów – wielkość, ładunek

Modyfikacje liposomów – wielkość, ładunek

elektryczny, ligandy powierzchniowe

elektryczny, ligandy powierzchniowe

PIERWSZA TERAPIA

PIERWSZA TERAPIA

GENOWA

GENOWA

14.09.1990 R. (M. Blaese, S. Rosenberg, W.F.

14.09.1990 R. (M. Blaese, S. Rosenberg, W.F.

Anderson)

Anderson)

Pacjentka – czteroletnia dziewczynka Ashanthi De

Pacjentka – czteroletnia dziewczynka Ashanthi De

Silva

Silva

Ciężki złożony niedobór odporności

Ciężki złożony niedobór odporności

(ang.

(ang.

Severe

Severe

Combined Immunodeficiency -

Combined Immunodeficiency -

SCID)

SCID)

Charakterystyka SCID:

Charakterystyka SCID:



brak enzymu deaminazy adenozyny (ADA)

brak enzymu deaminazy adenozyny (ADA)



cecha autosomalna recesywna

cecha autosomalna recesywna



selektywna toksyczność metabolitów adenozyny w

selektywna toksyczność metabolitów adenozyny w

stosunku do limfocytów T

stosunku do limfocytów T



ciężkie oportunistyczne zakażenia

ciężkie oportunistyczne zakażenia



wysoka śmiertelność

wysoka śmiertelność

Transfer genu

Transfer genu

ADA

ADA

do limfocytów.

do limfocytów.

PODSTAWOWE STRATEGIE

PODSTAWOWE STRATEGIE

ZASTOSOWANIA TERAPII

ZASTOSOWANIA TERAPII

GENOWEJ W

GENOWEJ W

NOWOTWORACH

NOWOTWORACH



Kompensacja mutacji onkogenów i genów

Kompensacja mutacji onkogenów i genów

supresorowych

supresorowych

(ang.

(ang.

mutation compensation

mutation compensation

)

)



Molekularna chemioterapia

Molekularna chemioterapia

(ang.

(ang.

molecular

molecular

chemotherapy

chemotherapy

)

)



Genetyczne wzmocnienie odpowiedzi

Genetyczne wzmocnienie odpowiedzi

immunologicznej

immunologicznej

(ang.

(ang.

genetic

genetic

immunopotentation

immunopotentation

)

)

NAJCZĘŚCIEJ STOSOWANE

NAJCZĘŚCIEJ STOSOWANE

STRATEGIE TERAPII

STRATEGIE TERAPII

GENOWEJ W

GENOWEJ W

NOWOTWORACH

NOWOTWORACH

Immunoterapia (

Immunoterapia (

ex vivo

ex vivo

)

)

23

23

45,1%

45,1%

Pro-lek (HSV-Tk/gancyklovir)

Pro-lek (HSV-Tk/gancyklovir)

11

11

21,7%

21,7%

Immunoterapia (

Immunoterapia (

in vivo

in vivo

)

)

7

7

13,7%

13,7%

Chemioprotekcja

Chemioprotekcja

4

4

7,8%

7,8%

Wprowadzanie genów

Wprowadzanie genów

supresorowych

supresorowych

4

4

7,8%

7,8%

Antysensowne nukleotydy

Antysensowne nukleotydy

2

2

3,9%

3,9%

51

51

100,

100,

%

%

(

(

S.H. Orkin, A.G. Motulsky, 1995; NIH

S.H. Orkin, A.G. Motulsky, 1995; NIH

USA

USA

)

)

KOMPENSACJA MUTACJI

KOMPENSACJA MUTACJI

Inhibicja funkcji onkogenu:

Inhibicja funkcji onkogenu:

a)

a)

zatrzymanie procesu transkrypcji określonego

zatrzymanie procesu transkrypcji określonego

onkogenu – zastosowanie antysensownych

onkogenu – zastosowanie antysensownych

oligonukleotydów tworzących strukturę potrójnej

oligonukleotydów tworzących strukturę potrójnej

helisy (tzw. DNA tripleksowy)

helisy (tzw. DNA tripleksowy)

b)

b)

zatrzymanie procesu translacji na matrycy mRNA

zatrzymanie procesu translacji na matrycy mRNA

określonego onkogenu – zastosowanie

określonego onkogenu – zastosowanie

antysensownego oligonukleotydu, który hybrydyzuje

antysensownego oligonukleotydu, który hybrydyzuje

z kodującymi sekwencjami mRNA onkogenu (np.

z kodującymi sekwencjami mRNA onkogenu (np.

oligonukleotyd komplementarny do

oligonukleotyd komplementarny do

K-Ras

K-Ras

mRNA)

mRNA)

c)

c)

zablokowanie funkcji onkoprotein w komórkach

zablokowanie funkcji onkoprotein w komórkach

docelowych – przez wykorzystanie

docelowych – przez wykorzystanie

„wewnątrzkomórkowych przeciwciał”, które blokują

„wewnątrzkomórkowych przeciwciał”, które blokują

działanie onkoprotein

działanie onkoprotein

Zastąpienie form zmutowanych genów

Zastąpienie form zmutowanych genów

supresorowych np. p53, RB1 (RB1 –

supresorowych np. p53, RB1 (RB1 –

retinoblastoma) formą niezmutowaną

retinoblastoma) formą niezmutowaną

(dziką) tych genów.

(dziką) tych genów.

STRATEGIE KOMPENSACJI

STRATEGIE KOMPENSACJI

MUTACJI

MUTACJI

*

*

Gen

Gen

Strategi

Strategi

a

a

Wektor

Wektor

Typ guza

Typ guza

p53

p53

zastąpie

zastąpie

nie genu

nie genu

adenowir

adenowir

us

us

rak „nie-

rak „nie-

drobnokomórkowy

drobnokomórkowy

” płuca, rak sutka,

” płuca, rak sutka,

rak prostaty,

rak prostaty,

przerzuty do

przerzuty do

wątroby raka jelita

wątroby raka jelita

grubego

grubego

RB

RB

zastąpie

zastąpie

nie genu

nie genu

adenowir

adenowir

us

us

rak pęcherza

rak pęcherza

BRCA-

BRCA-

1

1

zastąpie

zastąpie

nie genu

nie genu

retrowiru

retrowiru

s

s

rak jajnika

rak jajnika

Gen

Gen

Strateg

Strateg

ia

ia

Wektor

Wektor

Typ guza

Typ guza

K-Ras

K-Ras

antysen

antysen

s

s

retrowiru

retrowiru

s

s

rak „nie-

rak „nie-

drobnokomórkowy

drobnokomórkowy

” płuca

” płuca

c-myc

c-myc

c-fos

c-fos

antysen

antysen

s

s

retrowiru

retrowiru

s

s

rak sutka, rak

rak sutka, rak

prostaty

prostaty

IGF-1

IGF-1

antysen

antysen

s

s

kationow

kationow

e

e

liposomy

liposomy

glejaki

glejaki

*(

*(

Gomez-Navarro i wsp., Eur. J. Cancer, 1999,

Gomez-Navarro i wsp., Eur. J. Cancer, 1999,

867-885

867-885

)

)

MOLEKULARNA

MOLEKULARNA

CHEMIOTERAPIA

CHEMIOTERAPIA

Podawanie genów toksyn

Podawanie genów toksyn



Np. podawanie enzymów aktywujących

Np. podawanie enzymów aktywujących

prekursory leków, gen kinazy

prekursory leków, gen kinazy

tymidynowej wirusa HPV (

tymidynowej wirusa HPV (

HSV-tk

HSV-tk

)

)



Tego typu terapii genowej sprzyja tzw.

Tego typu terapii genowej sprzyja tzw.

efekt „sąsiedztwa” (ang.

efekt „sąsiedztwa” (ang.

bystander

bystander

effect

effect

)

)



Np. gen deaminazy cytozyny

Np. gen deaminazy cytozyny

5’-fluorocytozyna

5’-fluorocytozyna





5’-fluorouracyl

5’-fluorouracyl

Podawanie genów oporności na leki

Podawanie genów oporności na leki

Cel:

Cel:

ochrona komórek normalnych – głównie

ochrona komórek normalnych – głównie

macierzystych przed działaniem dużych

macierzystych przed działaniem dużych

dawek chemioterapeutyków

dawek chemioterapeutyków



Wykorzystuje się geny rodziny oporności

Wykorzystuje się geny rodziny oporności

wielolekowej (ang.

wielolekowej (ang.

multi drug resistant,

multi drug resistant,

MDR

MDR

)

)



Produkty tych genów (

Produkty tych genów (

MDR

MDR

) odgrywają

) odgrywają

rolę aktywnych transporterów związków

rolę aktywnych transporterów związków

cytotoksycznych, obniżając ich rzeczywiste

cytotoksycznych, obniżając ich rzeczywiste

stężenie w komórce.

stężenie w komórce.

Podawanie genów usprawniających

Podawanie genów usprawniających

wpływ konwencjonalnego leczenia

wpływ konwencjonalnego leczenia

antynowotworowego

antynowotworowego

Cel:

Cel:

uwrażliwienie komórek nowotworowych

uwrażliwienie komórek nowotworowych

na chemio- i radioterpię

na chemio- i radioterpię



Np. transfer genu cytochromu

Np. transfer genu cytochromu

wątrobowego P450 powoduje przemianę

wątrobowego P450 powoduje przemianę

cyklofosfamidu do 4-

cyklofosfamidu do 4-

hydroksycyklofosfamidu (rak sutka)

hydroksycyklofosfamidu (rak sutka)



Indukowanie apoptozy, np.

Indukowanie apoptozy, np.



włączenie do komórek genu

włączenie do komórek genu

p53

p53

,

,



wyłączenie funkcji genu

wyłączenie funkcji genu

bcl-2

bcl-2

GENETYCZNA MODYFIKACJA

GENETYCZNA MODYFIKACJA

KOMÓREK NOWOTWOROWYCH W

KOMÓREK NOWOTWOROWYCH W

CELU ZWIĘKSZENIA ICH

CELU ZWIĘKSZENIA ICH

IMMUNOGENNOŚCI

IMMUNOGENNOŚCI



Podawanie odpowiednio spreparowanych

Podawanie odpowiednio spreparowanych

(napromienionych) autologicznych lub

(napromienionych) autologicznych lub

allogenicznych komórek nowotworowych w

allogenicznych komórek nowotworowych w

połączeniu z adiuwantami np. z BCG.

połączeniu z adiuwantami np. z BCG.



Podawanie komórek prezentujących antygeny

Podawanie komórek prezentujących antygeny

MHC, np. komórek dendrytycznych

MHC, np. komórek dendrytycznych

preinkubowanych z antygenami nowotworowymi.

preinkubowanych z antygenami nowotworowymi.



Wprowadzenie genów dla układu MHC, np. HLA-

Wprowadzenie genów dla układu MHC, np. HLA-

B7 do komórek czerniaka.

B7 do komórek czerniaka.



Wprowadzenie do komórek nowotworowych

Wprowadzenie do komórek nowotworowych

genów dla antygenów nowotworowych, np. genu

genów dla antygenów nowotworowych, np. genu

dla antygenu MART-1 czerniaka.

dla antygenu MART-1 czerniaka.



Wprowadzenie do komórek nowotworowych

Wprowadzenie do komórek nowotworowych

genów dla cytokin, np. dla Il

genów dla cytokin, np. dla Il

-2, IFN-

-2, IFN-





,

,

czynnika GM-CFS

czynnika GM-CFS

*

*

.

.



Wprowadzenie do komórek nowotworowych

Wprowadzenie do komórek nowotworowych

genów dla cząstek B7.1 (CD80).

genów dla cząstek B7.1 (CD80).

*

*

GM-CFS – czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i

GM-CFS – czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i

makrofagów

makrofagów

GENETYCZNA MODYFIKACJA

GENETYCZNA MODYFIKACJA

IMMUNOLOGICZNYCH

IMMUNOLOGICZNYCH

KOMÓREK EFEKTOROWYCH

KOMÓREK EFEKTOROWYCH

Swoista immunoterapia komórkowa

Swoista immunoterapia komórkowa



Komórki TIL (ang.

Komórki TIL (ang.

Tumor Infiltrating

Tumor Infiltrating

Lymphocytes

Lymphocytes

) – heterogenna populacja

) – heterogenna populacja

limfocytów T o właściwościach

limfocytów T o właściwościach

cytotoksycznych w stosunku do

cytotoksycznych w stosunku do

autologicznych lub allogenicznych

autologicznych lub allogenicznych

komórek nowotworowych.

komórek nowotworowych.

Komórki
TIL

bezpośredni efekt
cytotoksyczny

wprowadzenie
genów dla np. Il-2,
TNF- 

IMMUNOTERAPIA BIERNA

IMMUNOTERAPIA BIERNA

NOWOTWORÓW

NOWOTWORÓW

PRZECIWCIAŁAMI

PRZECIWCIAŁAMI

MONOKLONALNYMI

MONOKLONALNYMI

Przeciwciała monoklonalne

Przeciwciała monoklonalne



tradycyjne

tradycyjne

, np. blokujące receptory na

, np. blokujące receptory na

komórkach nowotworowych.

komórkach nowotworowych.



połączone z radioizotopami

połączone z radioizotopami

, np. jodem

, np. jodem

radioaktywnym (

radioaktywnym (

131

131

I)

I)



połączone z enzymami

połączone z enzymami

np. w metodzie

np. w metodzie

„przeciwciało-enzym-prolek”.

„przeciwciało-enzym-prolek”.



o podwójnej swoistości

o podwójnej swoistości

:

:



swoiste do komórki efektorowej (np. limfocytu

swoiste do komórki efektorowej (np. limfocytu

T – anty-CD3)

T – anty-CD3)



swoiste do komórki docelowej (antygenu

swoiste do komórki docelowej (antygenu

związanego z nowotworem)

związanego z nowotworem)

METODY IMMUNOTERAPII

METODY IMMUNOTERAPII

NIESWOISTEJ

NIESWOISTEJ



Podawanie preparatów immunostymulujących

Podawanie preparatów immunostymulujących

(bakteryjnych, np. BCG, syntetycznych, np.

(bakteryjnych, np. BCG, syntetycznych, np.

lewamizol)

lewamizol)



Imunoterapia cytokinami, np.:

Imunoterapia cytokinami, np.:



IFN- - białaczka włochatokomórkowa, rak

nerki



Il-2

- rak nerki, czerniaki



Łączenie cytokin, np.:

Łączenie cytokin, np.:



Il-2 z

Il-2 z

IFN-

IFN-







TNF-  z

z

z

IFN-

IFN-





- mięsaki

- mięsaki