Bakteryjne wektory plazmidowe

- Koliste cząsteczki DNA wykorzystywane do wprowadzania

fragmentów DNA do bakterii, replikujące się niezależnie od
replikacji chromosomów,

- W obecności antybiotyków, które hamują syntezę białka i

replikację chromosomu bakteryjnego, same ulegają replikacji,

- Zapewniają powielanie wprowadzonego fragmentu DNA,
- Nie są niezbędne dla gospodarza, ale mogą zwiększyć jego

szanse przeżycia w pewnych warunkach,

- Wektory ekspresyjne dodatkowo pozwalają na ekspresję

genów zawartych we wprowadzanych fragmentach DNA i
produkcję białek

- Cechy kodowane przez plazmidy: oporność na antybiotyki,

jony metali ciężkich i działanie promieniowania UV,
wytwarzanie toksyn, zdolność do metabolizmu takich
związków jak kamfora i toluen

Gen oporności
na tetracyklinę

Gen oporności
na ampicylinę

Inicjacja replikacji – ori

Plazmid pBR322

Miejsca trawienia
przez enzymy
restrykcyjne

Składniki wektora bakteryjnego

- Sekwencja odpowiedzialna za inicjację replikacji, tzw.

sekwencja ori. Od tej sekwencji zależy specyficzność wektora, czyli

to w jakich komórkach może ulegać replikacji.
- Geny markerowe, czyli geny odpowiedzialne za łatwo

wyróżnialne cechy fenotypowe pozwalające odróżnić komórki, które

uległy transformacji od tych, które nie zostały stransformowane.
- Geny warunkujące oporność na antybiotyk:
- gen bla lub amp

r

kodujący enzym -laktamazę, która rozkłada

antybiotyki penicylinowe, np. ampicylinę. Ampicylina hamuje

enzymy uczestniczące w syntezie ściany komórkowej bakterii.
- gen tetA (tet

r

), który koduje pompę transbłonową zdolną do

usunięcia z komórki antybiotyku tetracykliny. Tetracyklina wiąże się

z podjednostką 30S rybosomów i hamuje translokację.
- gen Cm

r

(cat) – koduje białko, które w obecności acetyloCoA

katalizuje przemianę chloramfenikolu do pochodnych niezdolnych

do wiązania się z rybosomami. Chloramfenikol wiąże się z

podjednostką 50S rybosomów i hamuje biosyntezę białek.
- Geny warunkujące zdolność do syntezy łatwo oznaczalnego

enzymu: np. lacZ – gen kodujący - galaktozydazę.

- Miejsca rozpoznawane i trawione przez enzymy

restrykcyjne (polilinker). W miejscu polilinkera można wbudować

obcy DNA, co nie zaburza procesu replikacji.

Rekombinowany DNA

Nieistniejąca w naturze cząsteczka DNA

powstała poprzez połączenie fragmentów

różnych DNA

Trawienie DNA i enzymy restrykcyjne

Enzymy restrykcyjne czynnościowo są bakteryjnym

"układem immunologicznym" - chronią komórki bakterii przed
zakażeniem wirusowym poprzez trawienie materiału
genetycznego wirusa. Terminologia enzymów restrykcyjnych jest
odzwierciedleniem łacińskiej nazwy bakterii - pierwsza litera
pochodzi od rodzaju, a dwie następne - od gatunku, np. enzym

Eco

RI pochodzi z bakterii pałeczki okrężnicy (

E

scherichia

co

li).

Enzymy restrykcyjne rozcinają DNA mniej lub bardziej

swoiście, rozpoznając przed trawieniem określoną sekwencję
nukleotydów. Rozpoznawany odcinek może być różnej długości
(od 4 do 33 nukleotydów). DNA może zostać przecięty równo lub z
przesunięciem miejsca cięcia na obu łańcuchach o jeden, a nawet
pięć nukleotydów. W przypadku równego cięcia mówimy o
"tępych" końcach, a w przypadku nierównego cięcia o "lepkich"
końcach rozciętego łańcucha DNA.

Mechanizmem ochronnym przed trawieniem własnego

materiału genetycznego jest metylacja własnego DNA.

Nukleazy

Enzymy trawiące DNA i/lub RNA:

 endonukleazy

 egzonukleazy

Enzymy restrykcyjne

Specyficzne endonukleazy trawiące DNA

Np. enzym EcoRI z Escherichia coli (E. coli)

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

Sekwencja palindromowa

Ligacja DNA i ligazy

• Ligacja to łączenie fragmentów

DNA wiązaniami kowalencyjnymi.
W reakcji tej powstaje wiązanie
fosfodiestrowe pomiędzy grupą
hydroksylową jednego nukleotydu
(3’) a resztą fosforanową
drugiego nukleotydu (5’).

• Ligaza DNA – enzym, który

naprawia pęknięcia w jednej z
nici dwuniciowego DNA, na której
końcu 5’ znajduje się grupa
fosforanowa.

• Ligaza potrzebuje czynnika

adenylującego, aby zaktywować
grupę fosforanową i upodatnić ją
na atak grupy 3’ OH (np. ligaza
bakteriofaga T4 wykorzystuje do
tego ATP).

Topoizomerazy to enzymy konwertujące energię chemiczną
pochodzącą z ATP w energię torsyjnego napięcia cząsteczki o
superhelikalnej strukturze. In vivo topoizomerazy rozplatają
podwójną helisę DNA, udostępniając w ten sposób matrycę dla
enzymów replikacyjnych lub transkrypcyjnych.

DNA z 1
pozytywnym
skrętem

DNA z 1
negatywnym
skrętem

Ligacja DNA i topoizomerazy

Klonowanie genu to replikacja (powielanie)

wyizolowanego fragmentu DNA

Klonowanie DNA to sposób na amplifikację (powielenie)
wybranego fragmentu DNA in vivo. Plazmid zapewniający
oporność na niesprzyjające warunki środowiskowe rozcina się
enzymem restrykcyjnym lub enzymami restrykcyjnymi i tym
samym wycina się fragment DNA, który ma ulec powieleniu. Po
zmieszaniu produktów cięcia i połączeniu ich enzymem ligującym
(ligazą) uzyskuje się plazmid z wklonowanym obcym fragmentem
DNA. Następnie dodaje się ten plazmid do hodowli bakterii w
warunkach, w których mogą przeżyć tylko te komórki, które
pobiorą plazmid. Po wyhodowaniu ogromnej biomasy
drobnoustrojów izoluje się z nich DNA plazmidowy, a z niego
wycina się enzymami restrykcyjnymi interesujący nas,
sklonowany fragment DNA.

Trawienie DNA
enzymem EcoRI

Łączenie łańcucha DNA ligazą
DNA

topoizomeraza

topoizomeraza

fragment
DNA

Miejsca cięcia enzymami

restrykcyjnymi w obrębie

polilinkera

Plazmid z

genem 1

(niebieski)

Trawienie enzymami
restrykcyjnymi,
Oczyszczanie
liniowego plazmidu

Ligacja oczyszczonego plazmidu
z DNA kodującym

gen 2

(czerwony)

,

Oczyszczanie uzyskanego
kolistego plazmidu

Plazmid z nowym genem

Gen oporności

na antybiotyk

Plazmid
rekombinowany Chromosom

bakteryjny

DNA genomowy

z genem docelowym

Miejsca cięcia
enzymu(ów)
restrykcyjnego(ych)

Ligacja

Plazmi
d

Selekcja
klonów
zawierających
skonstruowany
nowy plazmid

Selekcja klonów
zawierających
skonstruowany
nowy plazmid z
wykorzystaniem
-galaktozydazy

kodowanej przez
gen lacZ –
hydrolizuje
laktozę do
glukozy i
galaktozy lub
syntetyczne
substraty, np. X-
Gal
(galaktopiranozy
d z dołączonym
niebieskim
barwnikiem)

Film