Białka struktura i funkcja

Badanie struktury i funkcji

białek

oczyszczanie i charakterystyka
oddziaływania białko – DNA,

charakterystyka oddziaływania białko-
białko

ekspresja i modyfikacje w różnych
typach komórek

Białka
składają się z aminokwasów
połączonych wiązaniem
peptydowym

Wiązanie

peptydowe

tworzy

się

między

grupami COOH i NH

kolejnych aminokwasów

aminokwas

Izolacja białek – liza komórek

Podstawowe metody lizowania komórek różnych typów:
Liza mechaniczna

Homogenizacja

Homogenizator nożowy (mikser)
Homogenizator Dounce’a
Homogenizator Pottera-Elvehjem’a

Sonikacja
Mrożenie /rozmrażanie
Moździerz

Liza z udziałem detergentów

Jonowych: SDS
Niejonowych (lub podwójnie jonowych): Triton X- , Nonidet
CHAPS

CHAPS

Dializa jest najprostszą metodą

oczyszczania roztworów białek z

substancji niskocząsteczkowych

Selekcja odpowiedniej błony dializacyjnej
- MWCO (molecular weight cut off)
- Odpowiednia objętość i mieszanie buforu
dializacyjnego

Małe cząsteczki białka
i jony przechodzą
przez pory w błonie
dializacyjnej i
stopniowo zmniejsza
się ich stężenie w
roztworze

Białka o dużej masie (na
rys. immunoglobulina )
pozostają wewnątrz
przestrzeni ograniczanej
błoną dializacyjną.

Nowsze komory dializacyjne pozwalają na dializę
niewielkich objętości mieszanin białkowych

W wielu przypadkach konieczne jest odsalanie
białek przy zachowaniu małej objętości próby.
Do tego celu stosuje się sita molekularne

Niektóre zanieczyszczenia: endotoksyny lub
albuminę usuwa się przy pomocy chromatografii
powinowactwa

Detergenty ulegające dializie: SDS, CHAPS

Metody oznaczania białek:

• UV (280 nm)

• Kolorymetryczne

Lowry
Coomassie
BCA

• Ekstrakcja buforami ułatwiającymi uzyskanie frakcji białek o

pożądanych właściwościach

• Selektywne wytrącanie

Opiera się na różnicach w rozpuszczalności białek.
Rozpuszczalność zależy od względnej równowagi
między oddziaływaniami białko-rozpuszczalnik, które
utrzymują

białko

stanie

rozpuszczonym

oddziaływaniami

białko-białko,

które

powodują

agregację i strącanie białek. Siła jonowa roztworu
decyduje o tym, który typ oddziaływań dominuje.

Metody izolacji białek

Wytrącanie siarczanem amonu

Niska  siła  jonowa  (niskie  stężenie  siarczanu  amonu)
–  sprzyja  oddziaływaniom  białko-rozpuszczalnik;
białka pozostają w roztworze
Wysoka siła jonowa (duże stężenie siarczanu amonu)
–  sprzyja  oddziaływaniom  białko-białko,  białka
agregują i wytrącają się

Stopniowe  dodawanie  siarczanu  amonu  do  ekstraktu
białkowego  prowadzi  do  selektywnej  precypitacji
różnych  typów  białek.  Białka  niepożądane  są
odrzucane.  Proces  jest  powtarzany  dopóki  nie
wytrącimy  frakcji  białek,  która  nas    interesuje.
Wytrącone

białka

mogą

zostać

ponownie

rozpuszczone.

Wytrącanie roztworem TCA (kwas
trójchlorooctowy)

Metoda pozwala na selektywną izolację pewnych
białek (np. białek HMG)

Selektywne wytrącanie

Elektroforeza białek

w warunkach denaturujących:

próby oraz bufor zawierają odczynnik

denaturujący białko (np. SDS lub mocznik)

Nanoszenie próby

Oznaczanie masy białka odbywa się w żelach

nieciągłych i denaturujących (w obecności

SDS)

Elektroforeza nieciągła

Schemat żelu do elektroforezy nieciągłej.
Oba żele maja różny skład elektrolitów, wartość
pH
oraz porowatość.

Przykład wyniku elektroforezy

białek

w obecności SDS; zdjęcie

zabarwionego żelu

M. Marker

białkowy

1. Ekstrakt z

hodowli

2. Oczyszczone

białko

Elektroforeza z ogniskowaniem w

punkcie izoelektrycznym

(Isoelectric Focusing)

Zasada rozdziału:
Zmiana ładunku elektrycznego cząsteczek
białkowych w zależności od pH roztworu, w
którym znajdują się cząsteczki

Przygotowywany w rurkach żel zawiera
mieszaninę amfolitów, które w polu
elektrycznym wytwarzają gradient pH.

Białka zatrzymują się podczas elektroforezy
w miejscu żelu
gdzie pH =punktowi izoelektrycznemu

Elektroforeza z ogniskowaniem w punkcie

izoelektrycznym jest używana jako pierwszy

etap elektroforezy dwukierunkowej

Izolacja białek

Metody rozdzielania białek

Selektywna precypitacja
Chromatografia

jonowymienna
filtracja na żelu
chromatografia powinowactwa

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym

SDS-PAGE
z ogniskowaniem izoelektrycznym
dwuwymiarowa

Chromatografia; zasady ogólne:

Mieszanina białek jest frakcjonowana w trakcie
ruchu przez porowate podłoże. Białka oddziałują z
dwoma fazami: ruchomą – rozpuszczalnikiem i
stałą – podłożem. Podłoże zawiera miejsca
wiązania białek. Wiązanie pojedynczych białek do
podłoża opóźnia ich ruch. Im większe
powinowactwo białka do podłoża tym wolniej
wędruje przez złoże podczas chromatografii.

Chromatografia kolumnowa
Złoże upakowane w kolumnie. Rozpuszczalnik
przechodząc przez kolumnę porywa cząsteczki
białka (ruch w dół kolumny)
Chromatografia cienkowarstwowa
Cienka warstwa złoża naniesiona na płytkę szklaną
lub celuloidową
Rozpuszczalnik wędruje ze zbiornika do góry
płytki
Białka o najmniejszym powinowactwie do złoża
wędrują z czołem rozpuszczalnika

Chromatografia kolumnowa

Chromatografia

cienkowarstwowa

(bibułowa)

jonowymienna

Chromatografia jonowymienna

Podstawą rozdziału są różnice w ładunku elektrycznym. Całkowity
ładunek białka zależy od sumy ładunków poszczególnych
aminokwasów i zależy od pH. Punktem izoelektrycznym białka
nazywamy pH w którym białko jest neutralne

Zwiększenie siły jonowej
powoduje osłabienie
wiązania podłoże-białko
i wymywanie
poszczególnych frakcji

Mikser gradientów pozwala na

utworzenie liniowego gradientu siły

jonowej (wzrastającego stężenia soli w

kolejnych warstwach)

Większe cząsteczki nie wchodzą do usieciowanej struktury granul
i

wymywane

są

w pustej objętości kolumny. Mniejsze cząsteczki wchodzą do
wnętrza

granul

i przebywają dłuższą drogę. Pusta objętość kolumny wynosi około
1/3 całkowitej objętości roboczej złoża.

Document Outline