Białka struktura i funkcja

Badanie struktury i funkcji

białek

oczyszczanie i charakterystyka
oddziaływania białko – DNA,

charakterystyka oddziaływania białko-
białko

ekspresja i modyfikacje w różnych
typach komórek

Białka

Regulacja transkrypcji
Regulacja translacji
Procesy metaboliczne

Białka
składają się z aminokwasów
połączonych wiązaniem
peptydowym

Wiązanie

peptydowe

tworzy

się

między

grupami COOH i NH

kolejnych aminokwasów

aminokwas

Izolacja białek – liza komórek

Podstawowe metody lizowania komórek różnych typów:
Liza mechaniczna

Homogenizacja

Homogenizator nożowy (mikser)
Homogenizator Dounce’a
Homogenizator Pottera-Elvehjem’a

Sonikacja
Mrożenie /rozmrażanie
Moździerz

Liza z udziałem detergentów

Jonowych: SDS
Niejonowych (lub podwójnie jonowych): Triton X- , Nonidet
CHAPS

CHAPS

Dializa jest najprostszą metodą

oczyszczania roztworów białek z

substancji niskocząsteczkowych

Selekcja odpowiedniej błony dializacyjnej
- MWCO (molecular weight cut off)
- Odpowiednia objętość i mieszanie buforu
dializacyjnego

Małe cząsteczki białka
i jony przechodzą
przez pory w błonie
dializacyjnej i
stopniowo zmniejsza
się ich stężenie w
roztworze

Białka o dużej masie (na
rys. immunoglobulina )
pozostają wewnątrz
przestrzeni ograniczanej
błoną dializacyjną.

Nowsze komory dializacyjne pozwalają na dializę
niewielkich objętości mieszanin białkowych

W wielu przypadkach konieczne jest odsalanie
białek przy zachowaniu małej objętości próby.
Do tego celu stosuje się sita molekularne

Niektóre zanieczyszczenia: endotoksyny lub
albuminę usuwa się przy pomocy chromatografii
powinowactwa

Detergenty ulegające dializie: SDS, CHAPS

Metody oznaczania białek:

• UV (280 nm)

• Kolorymetryczne

Lowry
Coomassie
BCA

• Ekstrakcja buforami ułatwiającymi uzyskanie frakcji białek o

pożądanych właściwościach

• Selektywne wytrącanie

Opiera się na różnicach w rozpuszczalności białek.
Rozpuszczalność zależy od względnej równowagi
między oddziaływaniami białko-rozpuszczalnik, które
utrzymują

białko

stanie

rozpuszczonym

oddziaływaniami

białko-białko,

które

powodują

agregację i strącanie białek. Siła jonowa roztworu
decyduje o tym, który typ oddziaływań dominuje.

Metody izolacji białek

Cząsteczki niepolarne w
roztworach wodnych
mają tendencję do
tworzenia agregatów

Słabe oddziaływania - wiązania hydrofobowe

Oddziaływania jonowe w roztworach

Wytrącanie siarczanem amonu

Niska siła jonowa (niskie stężenie siarczanu amonu)
– sprzyja oddziaływaniom białko-rozpuszczalnik;
białka pozostają w roztworze
Wysoka siła jonowa (duże stężenie siarczanu amonu)
– sprzyja oddziaływaniom białko-białko, białka
agregują i wytrącają się

Stopniowe dodawanie siarczanu amonu do ekstraktu
białkowego prowadzi do selektywnej precypitacji
różnych typów białek. Białka niepożądane są
odrzucane. Proces jest powtarzany dopóki nie
wytrącimy frakcji białek, która nas interesuje.
Wytrącone

białka

mogą

zostać

ponownie

rozpuszczone.

Wytrącanie roztworem TCA (kwas
trójchlorooctowy)

Metoda pozwala na selektywną izolację pewnych
białek (np. białek HMG)

Selektywne wytrącanie

Ładunek w białkach

Grupy karboksylowe
Grupy aminowe

Elektroforeza pionowa

(DNA, białka)

Elektroforeza białek

w warunkach denaturujących:

próby oraz bufor zawierają odczynnik

denaturujący białko (np. SDS lub mocznik)

Nanoszenie próby

Oznaczanie masy białka odbywa się w żelach

nieciągłych i denaturujących (w obecności

SDS)

Elektroforeza nieciągła

Schemat żelu do elektroforezy nieciągłej.
Oba żele maja różny skład elektrolitów, wartość
pH
oraz porowatość.

Elektroforeza pozioma

(kwasy nukleinowe, kompleksy kwasów

nukleinowych z białkami)

Elektroforeza natywna

Przy pomocy elektroforezy w żelu

poliakrylamidowym (SDS-PAGE) można

oszacować rozmiar nieznanego białka

Przykład wyniku elektroforezy

białek

w obecności SDS; zdjęcie

zabarwionego żelu

M. Marker

białkowy

1. Ekstrakt z

hodowli

2. Oczyszczone

białko

Elektroforeza z ogniskowaniem w

punkcie izoelektrycznym

(Isoelectric Focusing)

Zasada rozdziału:
Zmiana ładunku elektrycznego cząsteczek
białkowych w zależności od pH roztworu, w
którym znajdują się cząsteczki

Przygotowywany w rurkach żel zawiera
mieszaninę amfolitów, które w polu
elektrycznym wytwarzają gradient pH.

Białka zatrzymują się podczas elektroforezy
w miejscu żelu
gdzie pH =punktowi izoelektrycznemu

Elektroforeza z ogniskowaniem w punkcie

izoelektrycznym jest używana jako pierwszy

etap elektroforezy dwukierunkowej

Elektroforeza dwukierunkowa

Transfer elektroforetyczny

Izolacja białek

Metody rozdzielania białek

Selektywna precypitacja
Chromatografia

jonowymienna
filtracja na żelu
chromatografia powinowactwa

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym

SDS-PAGE
z ogniskowaniem izoelektrycznym
dwuwymiarowa

Chromatografia; zasady ogólne:

Mieszanina białek jest frakcjonowana w trakcie
ruchu przez porowate podłoże. Białka oddziałują z
dwoma fazami: ruchomą – rozpuszczalnikiem i
stałą – podłożem. Podłoże zawiera miejsca
wiązania białek. Wiązanie pojedynczych białek do
podłoża opóźnia ich ruch. Im większe
powinowactwo białka do podłoża tym wolniej
wędruje przez złoże podczas chromatografii.

Chromatografia kolumnowa
Złoże upakowane w kolumnie. Rozpuszczalnik
przechodząc przez kolumnę porywa cząsteczki
białka (ruch w dół kolumny)
Chromatografia cienkowarstwowa
Cienka warstwa złoża naniesiona na płytkę szklaną
lub celuloidową
Rozpuszczalnik wędruje ze zbiornika do góry
płytki
Białka o najmniejszym powinowactwie do złoża
wędrują z czołem rozpuszczalnika

Chromatografia kolumnowa

Chromatografia

cienkowarstwowa

(bibułowa)

jonowymienna

Chromatografia jonowymienna

Podstawą rozdziału są różnice w ładunku elektrycznym. Całkowity
ładunek białka zależy od sumy ładunków poszczególnych
aminokwasów i zależy od pH. Punktem izoelektrycznym białka
nazywamy pH w którym białko jest neutralne

Zwiększenie siły jonowej
powoduje osłabienie
wiązania podłoże-białko
i wymywanie
poszczególnych frakcji