Biologia molekularna 3

Replikacja DNA

Egbert

Piasecki

26-02-2014

Replikacja DNA

Replikon

– odcinek DNA replikujący się jako pojedyncza

jednostka

Bakterie, wirusy –

1 replikon

, synteza 300-1000

pz/s

Eukarionty –

wiele replikonów

, synteza na 1

replikonie: 10-100 pz/s

Ssaki – 50000-100000 replikonów, o wielkości 40-
200 kpz

(Gdyby był 1 replikon, to replikacja chromosomu
trwałaby 30 dni)

Czas kopiowania DNA w komórce zwierzęcej: 8 godz.

Kolejność replikacji:

1. Euchromatyna

2. Heterochromatyna

3. Centromery i telomery

Replikacja DNA

1.

DNA musi być replikowany w całości

Aparat replikacyjny – zespół białek replikujący DNA

2.

Replikacja musi być bezbłędna

Mutacje – trwałe zmiany w DNA, rzadko korzystne, zwykle
niekorzystne

Mechanizmy replikacji i naprawy DNA – ograniczają efekty

mutacji

3.

Tylko jednokrotna replikacja w czasie 1 podziału komórki

U prokariontów kolejna replikacja może się zacząć w czasie

trwania pierwszej. U eukariontów uniemożliwia to białkowy
czynnik ograniczający

Replikacja DNA

Replikacja DNA jest

semikonserwatywna

– każda z potomnych

dwuniciowych helis zawiera jeden łańcuch stary i jeden nowy

Początek replikacji

– rozplecenie nici DNA w

miejscach początku replikacji

(=

miejsca ori

)

– związanie białek

inicjujących (rozerwanie

wiązań

wodorowych): prokarionty - DnaA,

eukarionty – kompleks rozpoznający miejsce

inicjacji (ORC)

ori – szczególne sekwencje nukl.: dużo AT

(2 wiązania wodorowe)

Liczba miejsc ori:

Bakterie – 1

Drożdże – kilkaset

Ssaki – kilkadziesiąt
tysięcy, nie są

jednakowo
i jednocześnie

wykorzystywane, w kom.

embrionalnych jest

20x więcej miejsc ori niż w

kom. somatycznych

Replikacj

a DNA

Bakteryjny liniowy
DNA – start w
środku,
dwukierunkowa
replikacja

Replikacja DNA

Rozplecenie DNA umożliwia przyłączenie białek replikujących DNA

Widełki replikacyjne

W każdym miejscu
początku replikacji
tworzy się para
przeciwnie
zorientowanych widełek
replikacyjnych 

replikacja
dwukierunkowa

Replikacja DNA

Wykrywanie miejsc początku replikacji:

Wprowadzanie fragmentów DNA do plazmidów

Replikacja DNA

Polimeraza DNA

– tworzy wiązanie fosfodiestrowe między grupą OH na

końcu 3’ DNA a fosforanem 5” przyłączanego nukleotydu 

kierunek

5’3’

Szybkość replikacji:

bakterie – 1000 pz/s
człowiek (eukarionty) – 50

pz/s

(trudniejsza replikacja

wskutek

złożonej budowy

chromatyny)

Substrat reakcji – trifosforany
nukleozydów (uwolniona energia
wykorzystywana do
polimeryzacji)

Uwolniony pirofosforan (PPi)
ulega dalszej hydrolizie do
fosforanu nieorganicznego (Pi) 

reakcja polimeryzacji jest
nieodwracalna



06.1-

DNA_polymerase.mov

Replikacja DNA

Polimeraza DNA jest zasocjowana z DNA, przesuwa się wzdłuż DNA

Widełki replikacyjne są asymetryczne:

Nić wiodąca

– synteza ciągła

Nić opóźniona

– synteza krótkich fragmentów

(fragmenty Okazaki)

Replikacja DNA

Polimeraza DNA

– duża dokładność: 1 błąd na

10

7

nt

Polimeraza koryguje swoje błędy=

redagowanie

Redagowanie  aktywność

egzonukleazowa

w

kierunku

3’5’

Konieczność redagowania uniemożliwia

polimeryzację w kierunku 3’5’

Replikacja

DNA

Konieczność

redagowania
uniemożliwia
polimeryzację w
kierunku 3’5’

Replikacja DNA

Redagowanie

 aktywność egzonukleazowa w kierunku 3’5’

Replikacja DNA

Polimeraza może tylko dołączać

nukleotydy do już istniejącego łańcucha

Początek syntezy DNA

– synteza RNA o

długości ok. 10 nt (

starter

= primer)

przez enzym

prymazę

Synteza nici wiodącej – starter + synteza

ciągła DNA

Synteza nici opóźnionej – wiele starterów,

do połączenia w ciągły łańcuch
potrzebne są trzy dodatkowe aktywności
enzymatyczne:

● nukleaza – usuwa startery

● naprawcza polimeraza DNA –

syntetyzuje DNA

● ligaza DNA – łączy fragmenty

Wielkość fragmentu Okazaki odpowiada

wielkości DNA w nukleosomie

Prokariota

Eukariota

Starter

ok. 5 nt

ok. 10 nt

Fragment

Okazaki

1000-2000

nt

100-200 nt

Replikacja DNA

Aparat replikacyjny

– grupa białek

w widełkach replikacyjnych
zawierająca kompleks
wieloenzymatyczny:

◊

Helikaza DNA

– rozplata

dwuniciową strukturę
(prokarionty: DnaB)

◊

Prymaza DNA

(część polimerazy

 – synteza starterów)

◊

Polimeraza DNA

(prokarionty:

polimeraza DNA III, eukarionty:
polimeraza DNA )

◊

Białka wiążące

jednoniciowy

DNA (prokarionty: Ssb;
eukarionty: RP-A)

◊

Ruchoma obręcz

(białko) – ścisłe

wiązanie DNA z polimerazą



06.2-

DNA_helicase.mov



06.3-

sliding_clamp.mov

Replikacja DNA

Prymaza

nie ma mechanizmu

korekcyjnego – startery mają
stosunkowo dużo błędów

Naprawcza polimeraza DNA

(prokarionty: polimeraza DNA I,
eukarionty: polimeraza DNA )

ma mechanizm korekcyjny



06.4-

replication_I.mov



06.5-

DNA_replication_fork.mov

Replikacja DNA

Prymaza

działa jako hamulec molekularny wstrzymując polimerazę na

nici wiodącej

„Fabryki replikacyjne”

umiejscowione na matriks
jądrowej

Replikacja DNA

Prokarionty – cechy swoiste

1. Miejsce oriC przyłączone do błony komórkowej.

Region

oriC E.coli zawiera cztery miejsca wiązania

DnaA. Synteza

DnaA jest skorelowana ze wzrostem

komórki  szybszy

wzrost = szybsza inicjacja replikacji.

2. DNA nawija się wokół kompleksu 30-40

podjednostek

DnaA. Następuje rozplatanie

trzykrotnie powtórzonych 13-

nt sekwencji

bogatych w AT – przyłączenie DnaB (helikaza)

3. Białka wiążące jednoniciowy DNA (Ssb)

opłaszczają DNA

4. Przyłącza się prymaza  startery  polimeraza DNA III – dimer

zawierający podjednostki  (polimeraza) i  (egzonukleaza 3’5’)

5. Polimeraza DNA I – aktywność polimeraza 5’3’, egzonukleaza 5’3’ i

egzonukleaza 3’5’

6. Rozplatanie kolistego DNA prowadzi do powstawania dodatniej

superhelikalności. Gyraza DNA usuwa dodatnie superskręty. Inhibitory
gyrazy (nowobiocyna, kwas oksolinowy) – antybiotyki.

7. W miejscu terminacji produkt genu tus – inhibitor helikazy

8. Dwie potomne cząsteczki DNA (katenaty) rozłącza topoizomeraza IV

Replikacja DNA

Replikacja końców chromosomów

Bakterie – chromosom kolisty, brak końców

Eukariota – specjalne sekwencje wchodzące w skład telomerów, będące

miejscem wiązania telomerazy, u człowieka: TTAGGG

n

, n=kilkaset

Telomeraza

– dodaje sekwencje powtórzone na końcach chromosomów

Zahamowanie
aktywności
telomerazy w
komórkach
somatycznych
prowadzi do
stopniowego
skracania
chromosomów w
każdym pokoleniu
komórek. Gdy
skracanie sięgnie
sekwencji
kodujących komórki
umierają. Komórki
nowotworowe mają
reaktywowaną
telomerazę

Replikacja DNA

Replikacja końców chromosomów

Pętla na końcu chromosomu –

stabilizacja końców chromosomu,
brak lepkich końców

Telomeraza jest zmodyfikowaną

odwrotną transkryptazą zbudowaną z
białka i 450 rybonukleotydów, w tym
zawiera krótki RNA komplementarny
do sekwencji telomerów