SEKWENCJONOWANIE

SEKWENCJONOWANIE

• Technika ustalania kolejności

nukleotydów w sekwencji DNA

• Dzięki elektroforezie w żelu

poliakryloamidowym następuje

rozdział cząsteczek DNA różniących

się jednym nukleotydem

• Dwie metody wprowadzone w

latach 70tych

METODY SEKWENCJONOWANIA

METODY SEKWENCJONOWANIA

METODA CHEMICZNEJ DEGRADACJI DNA

(Maxama i Gilberta)

• Sekwencję DNA określa się działając na

wyznakowany radioaktywnie dwuniciowy DNA

związkami chemicznymi, które rozszczepiają

cząsteczki w specyficznych miejscach

poszczególnych nukleotydów

METODA TERMINACJI ŁAŃCUCHA

(Sangera,dideoksy)

• Sekwencję cząsteczki jednoniciowego DNA określa

się dzięki syntezie komplementarnych łańcuchów a

reakcje są zatrzymywane losowo w pozycjach

określonych nukleotydów

• Automatyczne sekwencjonowanie z

wykorzystaniem dideoksyrybonukleotydów

wyznakowanych fluorescencyjnie

CO POTRZEBUJEMY DO REAKCJI

CO POTRZEBUJEMY DO REAKCJI

SEKWENCJONOWANIA METODĄ

SEKWENCJONOWANIA METODĄ

TERMINACJI ŁAŃCUCHA?

TERMINACJI ŁAŃCUCHA?

• Jednoniciowa matryca – przed reakcją nić

DNA denaturujemy

• Starter

• Polimeraza DNA

• Trifosforany deoksyrybonukleotydów

dNTPy (Literki A, T, C, G)

• Trifosforany dideoksyrybonukleotydów

ddNTPy – pozbawione grupy 3’-

hydroksylowej, niezbędnej do utworzenia

reakcji z następnym nukleotydem

Sekwencjonowanie DNA

denaturacja

dwuniciowy DNA

jednoniciowy DNA
(matryca do sekwencjonowania)

przyłączenie znakowanego startera

starter

podział na 4 oddzielne reakcje

wydłużania startera

A T C G

rozdział produktów reakcji sekwencjonowania

w żelu poliakrylamidowym

pozostałe składniki reakcji

Sekwencjonowanie DNA

A T C G

G
A
C
C
T
G
A
C
T
G
T
A

5’

3’

CO OTRZYMUJEMY NA

CO OTRZYMUJEMY NA

KOŃCU?

KOŃCU?

Sekwencjonowanie DNA

denaturacja

dwuniciowy DNA

jednoniciowy DNA
(matryca do sekwencjonowania)

przyłączenie znakowanego startera

starter

podział na 4 oddzielne reakcje

wydłużania startera

A T C G

rozdział produktów reakcji sekwencjonowania

w żelu poliakrylamidowym

pozostałe składniki reakcji

Sekwencjonowanie DNA

A T C G

G
A
C
C
T
G
A
C
T
G
T
A

5’

3’