Regulacja ekspresji
genów

ramka odczytu (ORF)

Regulacja ekspresji beta-galaktozydazy – regulacja na poziomie
transkrypcji

start transkrypcji stop
transkrypcji

promoto
r

ramka
odczytu dla
beta-
galaktozyda
zy

bakterie wytwarzają
białko represorowe

gen kodujący
beta-
galaktozydazę

Brak laktozy: represor wiąże się do promotora,
polymeraza RNA nie może się przyłączyć do promotora,
brak transkryptu, brak biosyntezy białka beta-
galaktozydazy

wiąże
laktozę
wiąże DNA
promotora

polymeraza
RNA

brak transkrypcji
brak biosyntezy
białka

Laktoza dostępna: laktoza wiąże represor, białko
represorowe zmienia kształt i nie może wiązać się do DNA
promotora, polymeraza RNA wiąże się do promotora,
następuje transkrypcja i biosynteza białka beta-
galaktozydazy

laktoza

zmiana
kształtu
represora

promot
or

polymeraza RNA

transkrypcj
a

Film 1

NADMIAR ŻELAZA NIEDOBÓR ŻELAZA

Fur+Fe

2+

RyhB

sRNA RyhB

mRNA frn

Białko ferrytyna

ZWIĘKSZONE MAGAZYNOWANIE
ŻELAZA, ZMNIEJSZONE PRZYSWAJANIE
ŻELAZA (ZMNIEJSZONA SYNTEZA BIAŁEK
TRANSPORTUJĄCYCH ŻELAZO
DO WNĘTRZA KOMÓRKI)

ZMNIEJSZONE MAGAZYNOWANIE

ŻELAZA, ZWIĘKSZONE
PRZYSWAJANIE
ŻELAZA
(ZWIĘKSZONA SYNTEZA BIAŁEK

TRANSPORTUJĄCYCH ŻELAZO
DO
WNĘTRZA KOMÓRKI)

Nieaktywny represor
Fur

Aktywny represor
Fur

Fe

+2

TTGACAGATAATGATAATCATTATCTATAAT

-35

-10

Fe

+2

Fe

+2

TTGACAGATAATGATAATCATTATCTATAAT

-35

-10

Regulacja poziomu żelaza w komórkach bakteryjnych –

regulacja na poziomie transkrypcji

Polymeraza
RNA

Nadprodukcja białek

(ang.

overexpression)

Miejsca cięcia enzymami

restrykcyjnymi w obrębie

polilinkera

Plazmid z

genem 1

(niebieski)

Trawienie enzymami
restrykcyjnymi,
Oczyszczanie
liniowego plazmidu

Ligacja oczyszczonego plazmidu
z DNA kodującym

gen 2

(czerwony)

,

Oczyszczanie uzyskanego
kolistego plazmidu

Plazmid z nowym genem

Gen oporności

na antybiotyk

Plazmid
rekombinowany Chromosom

bakteryjny

DNA genomowy

z genem docelowym

Miejsca cięcia
enzymu(ów)
restrykcyjnego(ych)

Ligacja

Plazmi
d

Wprowadzanie obcego DNA do komórek

gospodarza

Transformacja

Bakterie gramdodatnie Bakterie
gramujemne

Wprowadzanie obcego DNA do komórek

Eukaryota

Transfekcja

fosforan
wapnia

sztuczne
liposomy

DEAE-
dekstran

Wprowadzanie obcego DNA do komórek

Eukaryota

Transfekcja

lipidy
kationowe

wiązanie
do błony
komórkow
ej

endocytoza

transfer
do
cytoplazm
y

degradacja
przez
lizosom

Oporność bakterii na antybiotyki
wykorzystana do selekcji
właściwych klonów, czyli bakterii
zawierających plazmid z
badanym genem

Antybiogram
– wykazanie
oporności
bakterii na
działanie
antybiotykó
w

Działanie
antybiotykó
w

Nadprodukcja
białek w
systemach
prokariotycznyc
h i
eukariotycznych

Transfekcja
Transformacja
(komórki ssacze) (bakterie lub
drożdże)

Detekcja i oczyszczanie białka

Transformacja – wprowadzanie
DNA do komórek bakterii, drożdży:
metoda chemiczna (działanie
solami metali dwuwartościowych,
np. CaCl

2

) lub elektroporacja

(działanie prądem elektrycznym o
wysokim napięciu)
Transfekcja – wprowadzanie DNA
do komórek ssaczych, owadzich
(elektroporacja, działanie
związkami lipidowymi)

Regulacja ekspresji beta-galaktozydazy – regulacja na poziomie
transkrypcji

start transkrypcji stop
transkrypcji

promoto
r

ramka
odczytu dla
beta-
galaktozyda
zy

bakterie wytwarzają
białko represorowe

gen kodujący
beta-
galaktozydazę

Brak laktozy: represor wiąże się do promotora,
polymeraza RNA nie może się przyłączyć do promotora,
brak transkryptu, brak biosyntezy białka beta-
galaktozydazy

wiąże
laktozę
wiąże DNA
promotora

polymeraza
RNA

brak transkrypcji
brak biosyntezy
białka

Laktoza dostępna: laktoza wiąże represor, białko
represorowe zmienia kształt i nie może wiązać się do DNA
promotora, polymeraza RNA wiąże się do promotora,
następuje transkrypcja i biosynteza białka beta-
galaktozydazy

laktoza

zmiana
kształtu
represora

promot
or

polymeraza RNA

transkrypcj
a

E. coli BL(DE3)

T7

Nadprodukcja białek w bakteriach Escherichia coli

Induktor nadprodukcji białek –
IPTG
(izopropylotiogalaktopiranozy
d)

Induktor (IPTG)
inaktywuje białko
represorowe

Wiązanie represora
blokuje transkrypcję

Represo
r Lac

Kataboliz
m laktozy

-galaktozydaza Permeaza

Transacetylaza

Promotor T7 rozpoznawany jest przez polimerazę T7 RNA
kodowaną w genomie E. coli. Ekspresja genu dla polimerazy T7
RNA kontrolowana jest przez promotor lac, który rozpoznawany
jest przez bakteryjną polimerazę RNA (jej gen znajduje się w
genomie bakteryjnym).

Oporność bakterii na antybiotyki
wykorzystana do selekcji
właściwych klonów, czyli bakterii
zawierających plazmid z
badanym genem

Antybiogram
– wykazanie
oporności
bakterii na
działanie
antybiotykó
w

Działanie
antybiotykó
w

Wektory

Plazmidy i wirusy stosowane jako nośniki obcych

genów

Wprowadzają obce geny do komórki gospodarza

Mają zdolność do autonomicznej replikacji w

komórkach docelowych

Plazmidy

Koliste cząsteczki DNA obecne w komórkach

bakteryjnych

Replikują się niezależnie od chromosomu

bakteryjnego

Wirusy

Pochodne wirusa krowianki, bakulowirusów,

adenowirusów, retrowirusów

Wprowadzanie obcego DNA do komórki

Metoda chemiczna - działanie solami metali
dwuwartościowych, np. chlorkiem wapnia,
chlorkiem magnezu, chlorkiem litu

Elektroporacja – krótkotrwałe działanie prądem
elektrycznym o wysokim napięciu

Metody transformacji czyli wprowadzania

obcego DNA do komórek

Bakterie i drożdże

Wprowadzanie obcego DNA do komórek

gospodarza

Transformacja

Bakterie gramdodatnie Bakterie
gramujemne

oczyszczone
białko

*

plazmid

DNA
kodujący
insulinę

bakterie

plazmi
d

DNA

dawca
DNA

bakteri
a

insulin
a

transkrypcja i
translacja

Produkcja białek w
bakteriach

rekombinowa
ny

produkcja białka

Wprowadzanie obcego DNA do komórek

Eukaryota

Transfekcja

fosforan
wapnia

sztuczne
liposomy

DEAE-
dekstran

Wprowadzanie obcego DNA do komórek

Eukaryota

Transfekcja

lipidy
kationowe

wiązanie
do błony
komórkow
ej

endocytoza

transfer
do
cytoplazm
y

degradacja
przez
lizosom

Rekombinacja – wymiana fragmentów
DNA

plazmid

plazmi
d

czynnik
transfekcyj
ny

Ekspresja wprowadzonych genów:

1. Bezpośrednio z plazmidu

2. Po wbudowaniu genu

do chromosomu

Plazmidy Ti z Agrobacterium tumefaciens kodują geny
odpowiedzialne za syntezę pochodnych aminokwasów, tzw.
opin , które bakterie wykorzystują jako źródło węgla. Na
plazmidzie są również kodowane geny sterujące
katabolizmem opin, warunkujące transfer plazmidu i jego
replikację.

Część tego plazmidu, tzw. T-DNA, po zakażeniu ulega
integracji z genomem rośliny. W ten region można
wprowadzić obcy DNA, a uzyskany konstrukt wprowadzić do
komórki roślinnej. Na obu jego końcach leżą krótkie
powtórzenia (24-25 par zasad) niezbędne do integracji z
genomem. W procesie przenoszenia T-DNA do komórki
roślinnej uczestniczą także geny plazmidowego regionu vir i
pewne geny zlokalizowane na chromosomie bakterii.

Wprowadzanie DNA do komórek

roślinnych za pomocą wektora

Tworzenie roślin

transgenicznych z udziałem

Agrobacterium

Agrobacteri
um

plazmid

przecięcie
plazmidu

wycięcie genu z
chromosomu

połączenie
genu z
plazmidem

transgeniczn
y rzepak

Bawełna transgeniczna z
wprowadzonym genem
insektycydu

Ryż (Golden
Rice) z
wprowadzonym
i genami
syntezy
prowitaminy A

Rośliny
transgeniczne