Enzymologia
1
Michał Świec
Enzymologia
1
Michał Świec
Jednostki aktywności:
1. Jednostka międzynarodowa, standardowa, uniwersalna, jest to tak
ilość enzymu, która przekształca 1 mol substratu w ciągi 1 min
w optymalnym pH w temp 30
C i przy nadmiarze substratu.
2.
Katal
– jest to taka ilość enzymu, która przekształca 1 mol
substratu w ciągu 1 sec
w temp 30
C przy optymalnym pH i przy nadmiarze substratu.
Ponieważ jest to jednostka bardzo duża, dlatego stosuje się częściej
milikatale, mikrokatale, nanokatale.
3. Aktywność właściwa – jest to ilość jednostek uniwersalnych
standardowych lub katali przeliczona na 1 mg białka przy
optymalnym pH. Tę jednostkę stosuje się najczęściej przy
oczyszczaniu enzymów.
4. Liczba obrotów (aktywność molekularna) – jest to ilość moli
substratu przekształcona przez 1 mol enzymu w ciągu 1 min w temp
30
C przy optymalnym pH. Stosuje się ją wtedy, gdy znana jest masa
molowa enzymy jak również liczba centrów aktywnych
1 kat
= 1mol\ s = 60
mol\min=
=60 x 10
6
mol\min=
6 x 10
7
U
1 U
=1 mol\min = 1/60 mol\s
=
=1/60 kat =
16,67 x 10
-9
kat
kat\l-aktywność roztworu
kat\mol E-aktywność molekularna
kat\kg białka-aktywność właściwa
Aktywność
Aktywność
0,72 mmol\h\ml kat\l [mol\l \l]
0,72 x 10
-3
mol
3600 s
= 0,2 x 10
-3
x10
-3
=2 x 10
–7
mol\s
ml
2 x 10
–7
x 10
6
10
–3
=2 x 10
2
kat\l
Aktywność
1,4 nkat\ml
mmol\min\l
nkat=nmol\s
1,4 nmol\s
mmol\min
1,4 x 10
-
6
x 60= 84 x 10
–
6
mmol\min
ml
l
84 x 10
–
6
10
–
3
= 84 x10
–
3
mmol\min\l
Monitoring Progress of
Purification Protocol
Total protein (mg)
Quantity of protein present in fraction
Total activity (units of activity)
Use a portion of sample to determine activity.
Multiply activity by total volume to determine
total activity.
Monitoring Progress of
Purification Protocol
Specific activity (units of activity/mg)
Total activity
Total protein
% yield: measure of activity retained after
each step in procedure.
S.A. =
% yield =
Total activity at particular step
Total activity of initial extract
Monitoring Progress of
Purification Protocol
Purification level: Measure of increase in
purity of protein throughout procedure.
Purification =
Specific activity at particular step
Specific activity of initial extract
nieoczyszcony ekstrakt enzymu zawiera 10 g białka w 1 ml. 20
ltego ekstraktu wytwarza w warunkach optymalnych 0,23
moli produktu na minutę. Z 1500 ml ekstraktu strącono białko
i rozpuszczono je w 25 ml uzyskując r-r 5,6 %.20 ltego r-ru
wytwarza 10,8 moli produktu na minutę. Oblicz współczynnik
oczysczenia enzymu i % odysku.
1. Obliczyć aktywności specyficzne
2. Współczynnik oczyszczenia to iloczyn aktywności specyficznych na kolejnych etapach
3. Obliczyć aktywność całego r-ru na poszczególnych etapach oczyszczenia
4. % odzysku to
aktywność na danym etapie do aktywności wyjściowej razy 100%
Oznaczono szybkości początkowe (V
0
) dla reakcji
enzymatycznej przy różnych
stężeniach substratu [S].
[S]
1.
1 x 10
-1
2.
1 x 10
-2
3.
1 x 10
-3
4.
1 x 10
-4
5.
1 x 10
-5
6.
1 x 10
-5
7.
1 x 10
-6
8.
1 x 10
-6
(V
0
)
1. 27
2. 27
3. 26
4. 19,3
5. 15
6. 5,4
7. 3
8. 0,66
Obliczyć:
•
Km
•
Vmax
•
Vo dla [S] = 4 x 10
-5
i 8 x 10
-5
•
Vo dla [S] = 5 x 10
-3
•
Vo dla [S] = 5 x 10
-5
, jeżeli zostało
podwojone stężenie enzymu
[S]
K
[S]
V
m
maks
v