Biologia molekularna 7

Translacja

Egbert

Piasecki

27-03-2014

Kod genetyczny

Kodon złożony z 3 nukleotydów – kodony dla 20 aminokwasów

Poznanie kodu genetycznego

Syntetyczne mRNA (mRNA komórkowy był niszczony rybonukleazą)

Ustalono w ten sposób (Nirenberg i Matthaei):

UUU  Phe

CCC  Pro

AAA  Lys GGG  ??? (potrójna helisa, nie ulega

translacji)

Kod genetyczny

Khorama – mieszane polinukleotydy –

interpretacja niejednoznaczna

Nirenberg i Leder – trinukleotydy RNA

(pojedyncze kodony) 

rozszyfrowanie wszystkich kodonów

Kodony:

konwencja 5’3’

Kod genetyczny jest

zdegenerowany

(nadmiarowy). Kodony
synonimiczne – więcej niż 1 kodon
dla 1 aminokwasu

Kod ewoluował w sposób

minimalizujący efekty mutacji

Kod genetyczny

Kodony

STOP

:

UAA

– Ochre,

UAG

– Amber,

UGA

- Opal

Kod genetyczny

Kod jest

uniwersalny

= jednakowy dla wszystkich organizmów

Wskazuje to na wspólnego przodka. Być może istniały formy życia z
innym kodem, ale nie przetrwały

Niewielkie odstępstwa od uniwersalności kodu dotyczą DNA

mitochondrialnego i niektórych mikroorganizmów

Kod genetyczny

Ramka odczytu

Trzy możliwości odczytu 

tRNA

Cząsteczka adaptorowa rozpoznająca kodon (struktura antykodonu) i

odpowiedni aminokwas

tRNA

– transportujący RNA, transferowy RNA; wielkość 60-95 nt, zwykle

76 nt

Kształt liścia koniczyny

tRNA

tRNA zawiera wiele

modyfikowanych

zasad

(do

20% wszystkich), 50 typów modyfikacji, np. I
– inozyna,  – pseudourydyna, D –
dihydrourydyna

Modyfikacje

potranskrypcyjne

, np. deaminaza

antykodonowa zamienia A na I

tRNA

Dojrzewanie prokariotycznego tRNA

1. Przyjęcie struktury ramion i pętli przez transkrypt
2. Odcinanie sekwencji z końców 5’ i 3’ przez

RNazy D, E, F i P

3. Modyfikacja zasad

Dojrzewanie eukariotycznego tRNA

1. Przyjęcie struktury ramion i pętli

przez transkrypt

2. Odcinanie sekwencji z końców 5’ i 3’

przez RNazy

3. Dodanie sekwencji CCA do końca 3’

przez tRNA nukleotydylotransferazę

4. Usunięcie intronu
5. Modyfikacja zasad

RNaza P – rybozym (RNA + białko) katalizujący formowanie

końca 5’ tRNA u prokariontów i eukariontów

tRNA

Przyłączanie aminokwasów do tRNA (

aminoacylacja tRNA

) przez

syntetazy aminoacylo-tRNA

odrębne dla każdego aminokwasu (istnieje

20 syntetaz). Enzymy rozpoznają elementy identyfikujące w tRNA

Niektóre syntetazy mają mechanizmy

korekcyjne



07.4-

tRNA.mov

tRNA

Działanie tRNA:

1. Aminoacylacja tRNA (charging)

2. Aminoacylo-tRNA (charged tRNA, naładowany) wiąże się z kodonem
w mRNA

Błędy w działaniu syntetazy lub wiązania kodon-antykodon 

przyłączanie niewłaściwego aminokwasu

tRNA

Interakcja kodon-antykodon – antyrównoległe

ułożenie nici RNA

Kod jest

zdegenerowany

 dwie możliwości:

1. Dla 1 aminokwasu istnieje więcej niż 1 rodzaj tRNA

2. Jeden tRNA rozpoznaje więcej niż 1 kodon

Obie możliwości są prawdziwe. U ludzi tRNA prezentują 48 antykodonów

Reguła

tolerancji

(chwiejności, ang. wobble) – dwie pierwsze pozycje

kodonu-antykodonu są ściśle dopasowane, trzecia pozycja zmienna.
Inozyna w pozycji 5’ antykodonu umożliwia rozpoznanie różnych
kodonów

tRNA rozpoznają 1, 2 albo

3 kodony

Pozycja 5’

antykodonu

Zasada w kodonie

C

G

G

C, U

I

A, C, U

Rybosomy

Rybosom

– aparat do wytwarzania białek, kompleks złożony z ok. 80 białek

(białka rybosomowe) i 4 cząsteczek rybosomowego RNA (rRNA)

Podjednostki rybosomowe powstają w jądrze,

transportowane są do cytoplazmy

Wielkość rybosomów: w jednostkach Svedberga

(S) – szybkość sedymentacji w roztworze

Rybosomy

Podjednostka mała

– dopasowuje tRNA do kodonów mRNA (dekodowanie

informacji genetycznej), ma mechanizm korektorski

Podjednostka duża

– katalizuje powstawanie wiązań peptydowych

(aktywność peptydylotransferazy)

120 2904 1542 121 4718 158

1874 nt

31
białek

Rybosomy

Synteza białka w rybosomach:

1. Podjednostki rybosomowe łączą się ze sobą obejmując mRNA w pobliżu
końca 5’.

U prokariontów 8-13 nt powyżej kodonu inicjatorowego,

sekwencja bogata w puryny (sekwencja Shine-Dalgarno)

2. Rybosom przesuwa się wzdłuż mRNA w kierunku 5’3’
3. Dołączane są kolejne aminokwasy do peptydu (eukarionty 2 aa/s;
prokarionty 20 aa/s), synteza od końca N do końca C białka

4. Dysocjacja rybosomów po zakończeniu syntezy

Rybosom zawiera

jedno

miejsce wiązania mRNA i

trzy

miejsca wiązania

tRNA:

Miejsce A (od: aminoacylo-tRNA)

Miejsce P (od: peptydylo-tRNA)

Miejsce E (od: exit)

Rybosomy

Translacja

Etapy

syntezy

łańcucha peptydowego

Dołączanie kolejnych aminokwasów – enzym
peptydylotransferaza (część rybosomu)

Przesunięcia małej podjednostki rybosomu
względem dużej

O strukturze rybosomu decyduje

rRNA

rRNA – pofałdowane w

bardzo zwarte

struktury

tworzące rdzeń

rybosomu

Białka – na

powierzchni,

w zagłębieniach RNA,

stabilizują rdzeń RNA

Translacja

23S RNA dużej podjednostki formuje miejsca wiązania tRNA (A, P, E) oraz

miejsce katalityczne peptydylotransferazy  RNA ma działanie
enzymatyczne

RNA

RNA o aktywności katalitycznej = RYBOZYM

Hipoteza: RNA były pierwszymi enzymami. Rybosomy byłyby reliktami

wczesnego etapu rozwoju życia

Kodon inicjujący AUG

rozpoznawany przez specjalny tRNA (inicjatorowy

tRNA)

związany z

metioniną

(u bakterii

N-formylometionina

)  wszystkie nowo

powstałe

polipeptydy mają na początku metioninę (najczęściej później odcinaną)
Prokarionty: tylko fMet-tRNA może zająć miejsce P na rybosomie

Początek odczytu

wyznacza ramkę
odczytu

Translacja

U bakterii:

Sekwencja wiążąca rybosom (RBS, do 6 nt) przed kodonami AUG

mRNA często policistronowe – musi być inny system startu translacji niż

u eukariontów



07.9-

ribosome_ratchet.mov



07.5-translation_I.mov

Translacja

Inicjacja

(organizowanie kompleksu

rybosom-mRNA)

u prokariontów:

Organizacja kompleksu: mała i duża

podjednostka rybosomu, mRNA,
inicjatorowy aminoacylo-tRNA,
IF1, IF2, IF3, GTP

1. IF1 i IF3 wiąże się z podjednostką

30S uniemożliwiając wiązanie
dużej podjednostki (zapobieganie
formowaniu nieaktywnych
rybosomów)

2. IF2+GTP wiąże się do małej

podjednostki, co pozwala na
wiązanie inicjatorowego tRNA

Translacja

3. Podjednostka 30S przyłącza się

do mRNA w miejscu wiążącym
rybosom (RBS)

4. Wiązanie tRNA z AUG w mRNA.

Uwolnienie IF3
= Kompleks inicjujący 30S

5. Wiązanie podjednostki 50S.

Uwolnienie IF1 i IF2
= Kompleks inicjujący 70S

Efekt końcowy inicjacji;

umieszczenie inicjatorowego tRNA
w miejscu P (tylko ten tRNA może
być włączony do kompleksu w
miejscu P)



07.6-

translation_II.mov

Translacja

Elongacja u prokariontów:

1. Dostarczenie aminoacylo-tRNA

2. Tworzenie wiązań peptydowych (transpeptydacja)

3. Translokacja

Czynniki elongacyjne: EF-Tu, EF-Ts, EF-G

Terminacja

(uwolnienie łańcucha peptydowego)

u prokariontów:

Czynniki uwalniające – RF: RF1 rozpoznaje UAA i UAG, RF2 rozpoznaje UAA

i UGA, RF3 pomaga RF1 i RF2

RF powodują, że peptydylotransferaza przenosi polipeptyd na cząsteczkę

wody

Dysocjacja rybosomu na podjednostki

 07.8-

ribosome_elongation.mov

Translacja

Eukarionty – różnice w stosunku do prokariontów:

1. Więcej czynników białkowych eIF, ale tylko 1 czynnik uwalniający eRF

2. Kodon Start odnajdywany jest na drodze skanowania mRNA. Kodon AUG

musi być w odpowiednim kontekście sekwencyjnym: 5’-CCRCCAUGG-3’

3. Kodon inicjatorowy rozpoznawany przez Met-tRNA

Translacja

U eukariontów:

1. Inicjatorowy tRNA wiąże się z małą podjednostką

rybosomu (miejsce P) z udziałem czynników
inicjujących translację

2. Mała podjednostka rybosomu wiąże koniec 5’ mRNA

(rozpoznawany jest kap RNA)

3. Przesuwanie (5’3’) małej podjednostki rybosomu

w poszukiwaniu AUG

4. Odłączenie czynników inicjujących umożliwia

przyłączenie dużej podjednostki rybosomu.
Uformowanie kompleksu inicjującego 80S

5. Wiązanie aminoacylo-tRNA do miejsca A

6. Utworzenie wiązania peptydowego

7. Wydłużanie łańcucha peptydowego

Translacja

Koniec translacji

– kodon terminacyjny (Stop): UAA, UAG,

UGA

1. Z kodonami Stop w miejscu A wiążą się białkowy
czynnik uwalniający zmieniający aktywność
peptydylotransferazy

2. Uwolnienie gotowego białka

3. Uwolnienie mRNA i dysocjacja rybosomu

Zsyntetyzowane białko ulega spontanicznemu

pofałdowaniu. Niektóre białka wymagają chaperonów
(białek opiekuńczych)

Synteza białka trwa od 20 s do kilku minut

W komórce eukariotycznej wszystkie rybosomy tworzą

około 1 mln wiązań peptydowych na sekundę

Translacja

Jeden mRNA – wiele rybosomów (w odległości min. 80 nt) =

polirybosomy

(polisomy)

Równoczesna synteza wielu kopii

białka z jednego mRNA  szybsza
synteza wielu cząsteczek białka

U bakterii mRNA nie wymaga

dojrzewania  translacja zaczyna
się jeszcze w trakcie transkrypcji,
rybosomy podążają za polimerazą
RNA



07.7-

polyribosome.mov

Translacja

Różnice w translacji między prokariontami a eukariontami  podstawa

stosowania inhibitorów syntezy białka jako antybiotyków

Wiele antybiotyków to produkty eukariontów (grzybów) zajmujących te

same nisze ekologiczne co bakterie

Antybiotyki

21. i 22. aminokwas

Selenocysteina (Sec, SeCys) i pyrrolizyna (Pyl)

Aminokw

as

Kodon

Sekwencja swoista

Sec

UGA

SECIS

Pyl

UAG

PYLIS

Regulacja translacji

Kontrola translacji u prokariontów

1. Zmiana struktury mRNA zasłaniająca RBS

2. Utworzenie struktury spinki do włosów hamującej egzonukleazy

(dłuższy okres półtrwania)

3. Wytwarzanie antysensowych cząsteczek RNA hamujących translację

Kontrola translacji u eukariontów

1. Obecność wielu powtórzeń sekwencji 5’-AUUUA-3’ w rejonie

niekodującym naznacza mRNA do szybkiej degradacji

2. Białka wiążące się do mRNA hamują translację (ukryty mRNA)

Regulacja translacji

Sekrecja białek

Sekwencja sygnałowa (13-36 aa), u eukariontów rozpoznawana przez SRP

(cząstki rozpoznające sygnał)

Różne sekwencje N-końcowe wymuszają

transport białek do mitochondriów,
chloroplastów, jądra (NLS – sygnał
lokalizacji jądrowej, np. Lys-Lys-Lys-Arg-Lys)

Modyfikacja białek

Rozcinanie białka na pojedyncze łańcuchy

Glikozylacja, acetylacja, hydroksylacja, fosforylacja, metylacja

Stabilność białek

Rola reszty N-końcowej:

• stabilizacja (t

1/2

>20 godz.) – Ala, Cys, Gly, Met, Pro, Ser, Thr, Val

• krótki okres półtrwania (2-3 min) – Arg, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Trp, Tyr
• destabilizacja po uprzedniej modyfikacji chemicznej – Asn, Asp, Gln, Glu

Rola proteolizy:

1. Degradacja białek o krótkim czasie trwania (pod koniec założonego

czasu trwania)

2. Usuwanie białek uszkodzonych, nieprawidłowo zmodyfikowanych lub

pofałdowanych

Agregaty nieprawidłowo pofałdowanych białek  amyloid w

chorobach

neurodegeneracyjnych jak CJD, AD, ch. Huntingtona 

agregaty

uszkadzają komórki

Proteoliza – w lizosomach i w cytozolu (kompleksy enzymów

proteolitycznych – proteosomy)

Degradacja

Proteosom:

W centrum cylinder złożony z proteaz,

miejsca aktywne wewnątrz

Końce proteosomu – kompleks białkowy

(min. 10 różnych białek) rozpoznający

białka przeznaczone do degradacji

miejsca

aktywne proteaz

Rozpoznawanie białek przez proteosom – kowalencyjne związanie białek z

ubikwityną

– ubikwitynowanie przez specjalne enzymy

Ubikwitynowaniu podlegają:

• białka o krótkim czasie trwania, mające specjalne krótkie sekwencje

aminokwasów, destabilizującą resztę N-końcową

• białka zdenaturowane

• białka źle sfałdowane

• białka zawierające zmienione aminokwasy, np. utlenione

Enzymy ubikwitynujące

prawdopodobnie rozpoznają sekwencje

aminokwasów i/lub motywy konformacyjne normalnie znajdowane

wewnątrz białek

Regulacja

Wytwarzanie białka – wydajność

kolejnych etapów decyduje o

zawartości białka w komórce –

najczęściej regulacja ekspresji na

etapie inicjacji transkrypcji

RNA a początki życia

Hipoteza: ŚWIAT RNA

Hipoteza: ŚWIAT RNA

ŚWIAT RNA – przechowywanie informacji genetycznej

Centralna

rola

– katalizowanie reakcji chemicznych

w powstaniu życia

ŚWIAT DNA – DNA oraz białka

Pozostałości po świecie RNA – katalityczne RNA, rybosomy, maszyneria

splicingu (hipoteza świata RNA najlepiej tłumaczy istnienie tych
procesów)

RNA a początki życia

RNA mógłby kierować syntezą swojej kopii

1982 – odkrycie katalizujących właściwości RNA (rybozymy)

Rybozymy tego typu są w genomie wiroidów 

RNA a początki życia

Rybozymy

Katalizatory RNA są mniej wydajne od białkowych. Białko przeprowadza

reakcje szybciej i lepiej. Skład białka (20 aa) wobec składu RNA (4 nt)
sprawia, że białka mają większy potencjał jako enzymy

RNA a początki życia

Hipotetyczna budowa pierwotnej komórki:

Prosta błona otaczająca zestaw cząsteczek zdolnych do
autokatalitycznej replikacji (np. RNA) oraz składniki będące źródłem
materiałów i energii

Na rzecz hipotezy, że RNA jest starszy ewolucyjnie od DNA wskazują

różnice chemiczne:

• ryboza łatwo powstaje z aldehydu mrówkowego (wg symulacji

podstawowy składnik w warunkach pierwotnej Ziemi)

• deoksyryboza powstaje obecnie w komórkach z rybozy w reakcji

katalizowanej przez enzym białkowy

Prawdopodobnie DNA pojawił się później i przejął rolę przechowywania

informacji genetycznej (z wyjątkiem części wirusów i wiroidów)

RNA a początki życia

Obecność deoksyrybozy sprawia, że

łańcuchy DNA są chemicznie bardziej
stabilne niż RNA  DNA może tworzyć
łańcuchy dłuższe i mniej narażone na
uszkodzenia

Dwuniciowa helikalna struktura i

zastąpienie uracylu tyminą  ułatwia
(umożliwia) procesy naprawcze np. w
razie deaminacji cytozyny, zwiększa
stabilność DNA

Hipoteza (Nature 2006, 439, 130): wirusy

wynalazły DNA, aby
uniknąć zniszczenia
przez zakażane
komórki