Metody badania

programowanej śmierci

komórek

Angelina Sosnowska

Marzena Kalbarczyk

Stanisław Żuchowski

Programowana śmierć

komórki

• PCD – Programmed Cell Death
• Jest to proces fizjologiczny,

prowadzący do eliminacji zużytych lub
uszkodzonych komórek z organizmu.
Proces ten jest niezbędny do
zachowania odpowiedniej homeostazy
tkankowej

• Wymaga dostarczenia energii w

postaci ATP

Modelowe organy do

badania PCD

• Tapetum pylnikowe

–

możliwość analizy ciągłości rozwoju (od powstania
do zniszczenia i przekształcenia w okrywę pyłkową)

–

wysoki synchronizm rozwojowy wszystkich
komórek w

• pojedynczym mikrosporangium,
• całym pylniku i
• danym okółku pylników

ułatwiający pobieranie odpowiednich próbek
materiału

–

możliwość identyfikacji każdego etapu rozwoju
tapetum na podstawie fazy różnicowania pyłku

Modelowe organy do

badania PCD

• Płatki

Metoda mikroskopowa

• Analiza morfologii komórki
• Umożliwia na obserwację

komórkowych zmian
morfologicznych: tworzenie ciałek
apoptotycznych

Metoda mikroskopowa

• Wymaga rutynowego barwienia

hematoksyliną i eozyną barwniki wiążące
się z kw. nukleinowymi) komórek
apoptotycznych

– badanie za pomocą mikroskopu świetlnego

• Barwienia fluorochromami aktywnymi w

stosunku do DNA, takimi jak Hoechst,
DAPI, jodek propydyny czy 7-ADD

– badanie przy użyciu mikroskopu elektronowego

Badanie fragmentacji DNA

 Można wykazać po przeprowadzeniu rozdziału materiału

komórkowego w polu elektrycznym techniką
elektroforezy w 2% żelu

 Wykrywa ona krótkie odcinki DNA i w przypadku ich

występowania tworzy się "drabinka" DNA.

 W przypadku występowania większych odcinków DNA,

podczas zwykłej elektroforezy nie tworzy się typowa
drabinka. Można jednak obecność tych fragmentów wykryć
stosując modyfikacje z użyciem pól zmienianych pulsacyjnie.

 Metoda kometkowa- identyfikuje komórki apoptyczne,

ujawnia się wtedy charakterystyczny kształt komety. Ogon
tworzą zdegradowane DNA a główka to pozostałe DNA.

Metody cytometryczne

• Ich głównym zadaniem przy badaniu PCD

jest identyfikacja i ilościowy pomiar tego
zjawiska oraz odróżnienie go od martwicy.

• Metody te opierają się na stwierdzeniu

obecności w komórce
charakterystycznych dla danego rodzaju
śmierci markerów - biochemicznych lub
molekularnych.

• W technice tej w celu odróżnienia komórek

apoptotycznych od nekrotycznych stosuje się

dodatkowe barwienie jodkiem propidyny, który

łączy się z DNA

• Barwnik ten nie przenika przez barierę lipidową,

zatem znakuje tylko komórki ulegające nekrozie

• W ten sposób zieloną fluoresceinę emitować

będą jedynie komórki w stanie apoptozy

eksponujące na swojej powierzchni kompleks

fosfatydyloseryny i aneksyny V (białko)

• Natomiast komórki w stanie nekrozy, które

związały fosfatydyloserynę będą źródłem

czerwonego świecenia

Metody cytometryczne

• Obniżenie potencjału śródbłonkowego

mitochondriów – zjawisko

wykorzystywane w opracowaniu nowych

technik wykrywania procesu apoptozy

• W celu detekcji stosuje się fluorescencyjne

cząsteczki lipofilne, które w komórkach

zdrowych agregują w mitochondriach,

tworząc świecące na czerwono kompleksy

polimerowe

• Mitochondria które uległy apoptozie

emitują zieloną fluorescencję (ze względu

na obniżony potencjał błonowy)

Metody cytometryczne

Metoda „TUNEL”

• Metoda pozwala na wykrycie fragmentacji

nDNA (DNA jądra komórkowego)

• W tej metodzie powstałe w czasie

degeneracji DNA końce 3’ są znakowane

radioizotopowo lub fluorescencyjnie przy

pomocy enzymu terminalnej transferazy

• Przy użyciu autoradiografu wykonuje się

detekcję, poprzez przyłożenie błony

fotograficznej do preparatu. Na skutek

promieniowania błona ulega zaczernieniu

Metoda „TUNEL”

•

Komórki apoptyczne i nekrotyczne są TUNEL-

pozytywne, a żywe TUNEL-negatywne

•

W celu rożróżnienia komórek nekrotycznych od

apoptycznych przeprowadza się ich obserwację w

kierunku wyszukania większej liczby pęknięć DNA

•

Istnieją jednak doniesienia, że metoda TUNEL

może nie być w pełni specyficzna, gdyż nie

odróżnia przypadkowo pociętego DNA od

fragmentacji na oligonukleosomalne odcinki, stąd

zaleca się, by była stosowana równolegle z inną

metodą.

Identyfikacja fragmentacji

DNA in situ

• Jest to metoda polegająca na barwieniu

komórek przy użyciu egzogennej
polimerazy DNA

• W tej metodzie do wykrywania komórek

apoptycznych używa się enzymów
dających barwną reakcję, którą można
zaobserwować za pomocą mikroskopu
świetlnego lub fluorescencyjnego.

Metoda immunoenzymatyczna

ELISA

• Pozwala na wykrywanie kaspaz inicjatorowych

i/lub efektorowych w lizatach komórkowych

• Metoda ta służy także do oceny jakościowej i

ilościowej innych markerów apoptozy

• W metodach tych białka będące markerami

procesu apoptozy są rozpoznawane przez

odpowiednie przeciwciało monoklonalne

• Następnie utworzone kompleksy są

identyfikowane przez izotypowo- swoiste

przeciwciała poliklonalne sprzężone z

enzymem

Literatura:

• Smolewki P., Darzynkiewicz Z., 2003.

Współczesne metody badania apoptozy . Acta

Haematologica Polonica, nr 1, s. 35 – 47

• Leśniewska J., 2003. Tapetum pylnikowe w

aspekcie programowanej śmierci komórki.

Kosmos. Tom 52, nr 4, s. 399-412

• Rudnicka K. W., Szczęsna E., Miszczyk E.,

2011. Apoptoza i autofagia- mechanizmy i

metody detekcji. Postępy Biologii Komórki, 2:

247-265

• http://www.abnova.com/support/resources.as

p?switchfunctionid={CBB86AB6-2EA6-422F-

BBBD-1CB8B9DCE6FA}