Metody badania

programowanej śmierci 

komórek

Angelina Sosnowska 

Marzena Kalbarczyk

 Stanisław Żuchowski

Programowana śmierć 

komórki

• PCD – Programmed Cell Death
• Jest to proces fizjologiczny, 

prowadzący do eliminacji zużytych lub 
uszkodzonych komórek z organizmu. 
Proces ten jest niezbędny do 
zachowania odpowiedniej homeostazy 
tkankowej

• Wymaga dostarczenia energii w 

postaci ATP

Modelowe organy do 

badania PCD

• Tapetum pylnikowe

–

możliwość analizy ciągłości rozwoju (od powstania 
do zniszczenia i przekształcenia w okrywę pyłkową)

–

wysoki synchronizm rozwojowy wszystkich 
komórek w

• pojedynczym mikrosporangium, 
• całym pylniku i 
• danym okółku pylników

ułatwiający pobieranie odpowiednich próbek 
materiału

–

możliwość identyfikacji każdego etapu rozwoju 
tapetum na podstawie fazy różnicowania pyłku

Modelowe organy do 

badania PCD

• Płatki

Metoda mikroskopowa

• Analiza morfologii komórki
• Umożliwia na obserwację 

komórkowych zmian 
morfologicznych: tworzenie ciałek 
apoptotycznych

Metoda mikroskopowa

• Wymaga rutynowego barwienia 

hematoksyliną i eozyną barwniki wiążące 
się z kw. nukleinowymi)  komórek 
apoptotycznych

– badanie za pomocą mikroskopu świetlnego 

• Barwienia fluorochromami aktywnymi w 

stosunku do DNA, takimi jak Hoechst, 
DAPI, jodek propydyny czy 7-ADD 

– badanie przy użyciu mikroskopu elektronowego

Badanie fragmentacji DNA

 Można wykazać po przeprowadzeniu rozdziału materiału 

komórkowego w polu elektrycznym techniką 
elektroforezy w 2% żelu

 Wykrywa ona krótkie odcinki DNA i w przypadku ich 

występowania tworzy się "drabinka" DNA. 

 W przypadku występowania większych odcinków DNA, 

podczas zwykłej elektroforezy nie tworzy się typowa 
drabinka. Można jednak obecność tych fragmentów wykryć 
stosując modyfikacje z użyciem pól zmienianych pulsacyjnie.

 Metoda kometkowa- identyfikuje komórki apoptyczne,  

ujawnia się wtedy charakterystyczny kształt komety. Ogon 
tworzą zdegradowane DNA a główka to pozostałe DNA.

Metody cytometryczne

• Ich głównym zadaniem przy badaniu PCD 

jest identyfikacja i ilościowy pomiar tego 
zjawiska oraz odróżnienie go od martwicy.

• Metody te opierają się na stwierdzeniu 

obecności w komórce 
charakterystycznych dla danego rodzaju 
śmierci markerów - biochemicznych lub 
molekularnych.

• W technice tej w celu odróżnienia komórek 

apoptotycznych od nekrotycznych stosuje się 

dodatkowe barwienie jodkiem propidyny, który 

łączy się z DNA

• Barwnik ten nie przenika przez barierę lipidową, 

zatem znakuje tylko komórki ulegające nekrozie 

• W ten sposób zieloną fluoresceinę emitować 

będą jedynie komórki w stanie apoptozy 

eksponujące na swojej powierzchni kompleks 

fosfatydyloseryny i aneksyny V (białko)

• Natomiast komórki w stanie nekrozy, które 

związały fosfatydyloserynę będą źródłem 

czerwonego świecenia

Metody cytometryczne

• Obniżenie potencjału śródbłonkowego 

mitochondriów – zjawisko 

wykorzystywane w opracowaniu nowych 

technik wykrywania procesu apoptozy

• W celu detekcji stosuje się fluorescencyjne 

cząsteczki lipofilne, które w komórkach 

zdrowych agregują w mitochondriach, 

tworząc świecące na czerwono kompleksy 

polimerowe

• Mitochondria które uległy apoptozie 

emitują zieloną fluorescencję  (ze względu 

na obniżony potencjał błonowy)

Metody cytometryczne

Metoda „TUNEL”

• Metoda pozwala na wykrycie fragmentacji 

nDNA (DNA jądra komórkowego)

• W tej metodzie powstałe w czasie 

degeneracji DNA końce 3’ są znakowane 

radioizotopowo lub fluorescencyjnie przy 

pomocy enzymu terminalnej transferazy

• Przy użyciu autoradiografu wykonuje się 

detekcję, poprzez przyłożenie błony 

fotograficznej do preparatu. Na skutek 

promieniowania błona ulega zaczernieniu

Metoda „TUNEL”

•

Komórki apoptyczne i nekrotyczne są TUNEL-

pozytywne, a żywe TUNEL-negatywne

•

W celu rożróżnienia komórek nekrotycznych od 

apoptycznych przeprowadza się ich obserwację w 

kierunku wyszukania większej liczby pęknięć DNA

•

Istnieją jednak doniesienia, że metoda TUNEL 

może nie być w pełni specyficzna, gdyż nie 

odróżnia przypadkowo pociętego DNA od 

fragmentacji na oligonukleosomalne odcinki, stąd 

zaleca się, by była stosowana równolegle z inną 

metodą.

Identyfikacja fragmentacji 

DNA in situ

• Jest to metoda polegająca na barwieniu 

komórek przy użyciu egzogennej 
polimerazy DNA

• W tej metodzie do wykrywania komórek 

apoptycznych używa się enzymów 
dających barwną reakcję, którą można 
zaobserwować za pomocą mikroskopu 
świetlnego lub fluorescencyjnego.

Metoda immunoenzymatyczna 

ELISA

• Pozwala na wykrywanie kaspaz inicjatorowych 

i/lub efektorowych w lizatach komórkowych

• Metoda ta służy także do oceny jakościowej i 

ilościowej innych markerów apoptozy

• W metodach tych białka będące markerami 

procesu apoptozy są rozpoznawane przez 

odpowiednie przeciwciało monoklonalne

• Następnie utworzone kompleksy są 

identyfikowane przez izotypowo- swoiste 

przeciwciała poliklonalne sprzężone z 

enzymem

Literatura:

• Smolewki P., Darzynkiewicz Z., 2003. 

Współczesne metody badania apoptozy . Acta 

Haematologica Polonica, nr 1, s. 35 – 47  

• Leśniewska J., 2003. Tapetum pylnikowe w 

aspekcie programowanej śmierci komórki. 

Kosmos. Tom 52, nr 4, s. 399-412

• Rudnicka K. W., Szczęsna E., Miszczyk E., 

2011. Apoptoza i autofagia- mechanizmy i 

metody detekcji. Postępy Biologii Komórki, 2: 

247-265

• http://www.abnova.com/support/resources.as

p?switchfunctionid={CBB86AB6-2EA6-422F-

BBBD-1CB8B9DCE6FA}