Czułość pomiarów NMR
Czułość pomiarów NMR
Intensywność ~ [stężenie] (Int ~ c)
Efekt akumulacji: S/N ~ nt
1/2
nt – liczba zsumowanych
sygnałów FID
Moment magnetyczny jądra i pole B
0
: Int ~
(5/2)
B
0
(3/2)
Efekt NOE:
Int(
max
) = (1 +
S
/2
I
) Int
0
Przeniesienie polaryzacji S I:
Int
max
=
S
/
I
Niektóre czynniki wpływające na jakość rejestrowanego widma
Schemat sekwencji INEPT ogniskowany
(INEPT = Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer)
Wąskie prostokąty reprezentują
impulsy 90º a szerokie – impulsy 180º.
Inne oznaczenia:
t
d
– przerwa relaksacyjna, w której
układ dochodzi do stanu równowagi
termodynamicznej z otoczeniem,
d
2
= 1/(4J),
d
3
= (0,15 - 0,25)/J,
at – czas rejestracji FID
90 180
180
90 180
180
90
t
d
d
2
d
3
d
3
d
2
odsprz.
I
S
A B
CD
E
at
Postać multipletów spinu I w grupach IS, IS
2
i IS
3
,
rejestrowanych za pomocą sekwencji INEPT z kompensacją
równowagowej intensywności spinu I.
CH
CH
2
CH
3
Wzmocnienie sygnału spinów I spowodowane przeniesieniem
polaryzacji od spinów S w technice DEPT
Układ
spinowy
= 45º
= 90º = 135º
IS
0,71(
S
/
I
)
(
S
/
I
)
0,71(
S
/
I
)
IS
2
(
S
/
I
)
0
–(
S
/
I
)
IS
3
1,06(
S
/
I
)
0
1,06(
S
/
I
)
Standardowe widmo
13
C NMR i widmo DEPT(135) próbki sacharozy
zanieczyszczonej metanolem, zarejestrowane z odsprzęganiem od
protonów
O
H
OH
H
H
OH
H
OH
CH
2
OH
H
CH
2
OH
H
CH
2
OH
OH
H
H
OH
O
O
3’
2’
1
2
4
3
1’
1”
C
C
H
C
C
Br
Sygnał główny i sygnały satelitarne acetylenowego protonu 1-
bromoetynylo-4-etynylobenzenu
≡C-H
ppm
Niektóre zaawansowane techniki
pomiarowe
Koncepcja spektroskopii wielowymiarowej
Sekwencja pomiarowa służąca do rejestracji standardowego widma
1D NMR:
(t
d
) – (impuls ) – (at)
Sekwencja pomiarowa służąca do rejestracji widma 2D NMR:
(t
d
) – (t
1
) – (t
m
) – (at)
Sekwencja pomiarowa służąca do rejestracji widma 3D NMR:
(t
d
) – (t
1
) – (t
m
) –
(t
3
) – (t
m2
) – (at)
Koncepcja spektroskopii wielowymiarowej
FT(t
2
)
FT(t
1
)
Poglądowe przedstawienie dwuwymiarowej spektroskopii NMR
Koncepcja spektroskopii wielowymiarowej
Etapy sekwencji pomiaru widma dwuwymiarowego:
przygotowanie, t
d
- wytwarzany jest nierównowagowy stan
układu spinowego
inkrementowany czas ewolucji, t
1
- znakowanie koherencji
spinowych częstościami
1
mieszanie,
t
m
-
przeniesienie
koherencji
pomiędzy
oddziałującymi spinami
detekcja, t
2
- rejestracja sygnału FID, zawierającego informacje
bezpośrednio o częstościach
2
i pośrednio o częstościach
1
Dwuwymiarowa technika COSY
Sekwencja COSY służąca do korelowania przesunięć
chemicznych spinów oddziałujących skalarnie
90
x
90
x
Dwuwymiarowa technika COSY
Schematycznie
przedstawione widmo 2D
typu COSY, w którym
korelacja spinów jest
wywoływana sprzężeniem
skalarnym.
Sygnały
diagonalne
(D)
odpowiadają widmu 1D
podczas gdy sygnały
niediagonalne
wskazują
na obecność sprzężenia
skalarnego pomiędzy
spinami.
2
1
D
D
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
1.0
1.0
2.0
3.0
3.0
WIDMO PROTONOWE KROTONIANU ETYLU
H
3
C
C C
C
O
O C
H
2
CH
3
H
H
H
H
H
H
H
WIDMO COSY KROTONIANU ETYLU
H
3
C
C C
C
O
O C
H
2
CH
3
H
H
Widmo 1D
1
H NMR
.
O
H
OH
H
H
OH
H
OH
CH
2
OH
H
CH
2
OH
H
CH
2
OH
OH
H
H
OH
O
O
Widmo 1D
1
H NMR roztworu sacharozy w D
2
O z dodatkiem
metanolu
O
H
OH
H
H
OH
H
OH
CH
2
OH
H
CH
2
OH
H
CH
2
OH
OH
H
H
OH
O
O
Widma COSY z filtrem dwukwantowym - DQF-COSY.
Widmo 2D
1
H-
1
H DQF-COSY roztworu sacharozy w D
2
O z dodatkiem
metanolu
1
2
3
1
2
3
Widmo 1D
1
H NMR roztworu sacharozy w D
2
O z dodatkiem
metanolu
O
H
OH
H
H
OH
H
OH
CH
2
OH
H
CH
2
OH
H
CH
2
OH
OH
H
H
OH
O
O
ppm (f1)
3.520
3.5 3
0
3. 540
3. 550
3.560
3.570
3.5 8
0
3. 590
p p m ( f1 )
3 .7 2 0
3 .7 3 0
3 .7 4 0
3 .7 5 0
3
. 7
6 0
3 .7 7 0
3 .7 8 0
3
. 7
9 0
3 .8 0 0
p p
m (f 1 )
5 .4 0 0
5 .4 5 0
1
2
3
1
2
3
Widmo 1D
1
H NMR
.
Widmo 1D
1
H NMR teakryny w CDCl
3
N
N
N
N
O
O
O
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
ppm
50
100
150
Widmo 1D
13
C NMR teakryny w CDCl
3
N
N
N
N
O
O
O
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
1
2
3
6
5
4
7
8
9
CDCl
3
Detekcja odwrotna. Widmo 2D
1
H-
13
C HMBC teakryny.
N
N
N
N
O
O
O
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
1
2
3
6
5
4
7
8
9
H7
C5
C8
H9
C4
H3
C2
H1
C6
Widmo 1D
1
H NMR teakryny w CDCl
3
N
N
N
N
O
O
O
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
1
2
3
6
5
4
7
8
9
1
3
7
9
Widmo 1D
1
H NMR teakryny w CDCl
3
ppm
50
100
150
Widmo 1D
13
C NMR teakryny w CDCl
3
2
6
5
4
8
N
N
N
N
O
O
O
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
1
2
3
6
5
4
7
8
9
Widmo 1D
13
C NMR teakryny w CDCl
3
Detekcja odwrotna. Widmo 2D
1
H-
13
C HSQC teakryny
N
N
N
N
O
O
O
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
H7
H9
H3
H1
C9
C7
C1
C3
ppm
50
100
150
Widmo 1D
13
C NMR teakryny w CDCl
3
1
2
3
6
5
4
7
8
9
N
N
N
N
O
O
O
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
1
2
3
6
5
4
7
8
9
Widmo 1D
13
C NMR teakryny w CDCl
3
Impulsowe gradienty pola magnetycznego
Częstość precesji spinów w polu magnetycznym B
0
z nałożonym
liniowym gradientem:
|
L
(z)| = (B
0
+ g
z
z)
180�
(a)
(b)
(a) Dwa impulsy gradientowe o przeciwnej polaryzacji
stanowiące najprostszą sekwencję ogniskującą
(b) Sekwencja gradientowego echa spinowego
Technika
Informacja
Inversion-recovery
Pomiar T
1
Spinowe echo
Wygaszanie szerokich linii i
zakłóceń, element innych
sekwencji, pomiary dyfuzji
CPMG
pomiar T
2
INEPT
Przenoszenie polaryzacji S I,
rejestracja I kontrolowana przez
T
1
(S)
DEPT
Przenoszenie polaryzacji S I,
rozróżnianie IS, IS
2
i IS
3
, „edycja”,
rejestracja I kontrolowana przez
T
1
(S), edycja widm
Najważniejsze techniki jednowymiarowej spektroskopii NMR
1D
Najważniejsze techniki dwuwymiarowej spektroskopii NMR
Technika
Informacja
Korelacje poprzez homojądrowe J
ij;
współrzędne δ(H
i
), δ(H
j
)
Cosy (Correlation spectroscopy)
sprzężenia par jąder
DQCOSY (Double-Quantum
Correlation COSY )
lepiej czytelne COSY, brak sygnałów singletowych na
diagonali
TOCSY (total correlation
spectroscopy)
wszystkie sprzężenia w obrębie całego układu
spinowego
Korelacje poprzez heterojądrowe J
ij;
współrzędne δ(X
i
), δ(H
j
)
(detekcja odwrotna)
HSQC (heteronuclear single
quantum
correlation)
sprzężenia przez jedno wiązanie
HMBC (heteronuclear multi
bondcorrelation)
sprzężenia przez więcej niż jedno wiązanie
HMQC (heteronuclear multi
quantum
correlation)
sprzężenia przez jedno lub więcej wiązań
(mniej selektywne)
Korelacje poprzez oddziaływania dipolowe (NOE); współrzędne δ(H
i
), δ(H
j
)
NOESY (NOE spectroscopy)
odległość pomiędzy H
i
i H
j
; zanika jeśli ω
0
c
~1
ROESY (rotating frame NOE SY)
odległości międzyjądrowe; działa również dla ω
0
c
=1
Korelacje przez wymianę chemiczną; współrzędne δ(X
i
), δ(X
j
)
EXSY (exchange SY)
schemat i szybkość wymiany chemicznej
Widmo
1
H NMR moczu - kwasica argininobursztynowa.
Asa - kwas
argininobursztynowy
Ala – alanina
Cr – kreatyna
Crn - kreatynina,
Dma – dimetyloamina
Gly - glicyna
Widmo
13
C NMR moczu pacjenta chorego na alkaptonurię
0
0
20
20
40
40
60
60
80
80
100
100
120
120
140
140
160
160
180
180
O
OH
OH
OH
1
1'
3
5
4
6
2
2'
1
1’
3
5
4
6
2
2’
U
0
0
20
20
40
40
60
60
80
80
100
100
120
120
140
140
160
160
180
180
0
0
20
20
40
40
60
60
80
80
100
100
120
120
140
140
160
160
180
180
O
OH
OH
OH
1
1'
3
5
4
6
2
2'
1
1’
3
5
4
6
2
2’
U