POBIERANIE I PRZECHOWYWANIE MATERIAŁÓW DO BADAŃ WIRUSOLOGICZNYCH I SEROLOGICZNYCH

POBIERANIE I

PRZECHOWYWANIE

MATERIAŁÓW DO BADAŃ

WIRUSOLOGICZNYCH I

SEROLOGICZNYCH

Dr n. wet. Łukasz Adaszek

Klinika Chorób Zakaźnych

Wydź. Med. Wet. Lublin

Diagnostyka schorzeń wirusowych

obejmuje dwa rodzaje czynności:



wykrycie obecności wirusa w

badanym materiale,



wykazanie immunologicznej

odpowiedzi organizmu na zakażenie.

W materiale klinicznym bezpośrednią

obecność wirusa można wykazać

metodami:



Mikroskopii elektronowej



Immunofluorescencji (wykrywanie

antygenów w leukocytach, wirusa

odry, cytomegalii)



Również inne metody takie jak PCR,

techniki hybrydyzacyjne z

radioaktywnymi sondami, metody

immunoenzymatyczne, choć drogie

pozwalają jednak na szybką diagnozę

schorzeń wirusowych.



Wykrycie wirusa polega najczęściej na

wyizolowaniu go z badanego materiału i

wykonaniu odczynu neutralizacji z

diagnostycznymi surowicami. Wirusem zakaża

się linie komórkowe, zarodki ptasie, bądź

zwierzęta laboratoryjne, a namnożony wirus

identyfikuje się serologicznie. O obecności

wirusa w badanym materiale mogą świadczyć

także: zmiany jakie wywołuje on w hodowlach

komórkowych (efekt cytopatyczny), śmierć

zakażonych zwierząt, bądź zakażonych

zarodków. Jednak na podstawie tylko tych

badań, nie jesteśmy w stanie powiedzieć z

jakim wirusem mamy do czynienia.



Niezwykle ważnym jest czas pobierania materiału

do badań wirusologicznych. Największa

wykrywalność ma miejsce w ostrej fazie choroby,

po wystąpieniu pierwszych objawów.



w okresie wylegania wykrywalność wirusa jest

mała



w okresie zachorowania jest już jednak duża



w ostrej fazie choroby wykrywalność jest

największa



w fazie zejściowej i w okresie rekonwalescencji

wykrywalność jest bardzo mała.

Okres

choroby

Wykrycie

wirusa

Wykrycie Ig w

surowicy

Okres

wylegania

rzadko

Okres

zachorowania

często

Faza ostra

Bardzo często

rzadko

Faza

zejściowa

rzadko

często

Okres

rekonwalesce

ncji

Bardzo rzadko

zawsze



Rozpoznanie zakażenia wirusowego

można dokonać także nie poprzez

wyizolowanie wirusa z badanego

materiału lecz metodami pośrednimi



Każdy kontakt wirusa z organizmem

uruchamia odpowiedź humoralną i

komórkową, a pojawiające się

przeciwciał są tego dowodem



In the upper pathway; foreign protein or antigen (1) is

taken up by an antigen-presenting cell (2). The antigen

is processed and displayed on an MHC II molecule (3),

which interacts with a T helper cell (4). In the lower

pathway; whole foreign proteins are bound by

membrane antibodies (5) and presented to B

lymphocytes (6), which process (7) and present

antigen on MHC II (8) to a previously activated T

helper cell (10), spurring the production of antigen-

specific antibodies (9).



Antigen presentation stimulates T

cells to become either "cytotoxic"

CD8+ cells or "helper" CD4+ cells.



scanning

electron

microscope

image of

a single

neutrophil

(yellow), engulfing

anthrax

bacteria (orange).



Przeciwciała utrzymują się niekiedy przez

całe lata, na ogół jednak jest to

uzależnione od rodzaju wirusa oraz statusu

immunologicznego organizmu. Do ich

wykrywania służą liczne testy serologiczne



Pobieranie materiału do tego typu badań

oparte jest o tzw. zasadę parzystego

pobierania surowic. Polega ona na

podwójnym pobraniu krwi do badania-

pierwszy raz jednocześnie z materiałem do

badań wirusologicznych; drugi w okresie

rekonwalescencji- 2,3 tygodnie po

ustąpieniu objawów choroby



Pierwsza surowicę przechowujemy po

wykonaniu badania i powtarzamy je

kolejny raz równocześnie z badaniem

surowicy z drugiego pobrania. W ten

sposób eliminujemy błąd związany z

warunkami odczynu. Jeżeli poziom

przeciwciał wzrósł czterokrotnie w drugiej

surowicy w porównaniu z pierwszą,

potwierdza to przyczynę choroby.

POBIERANIE MATERIAŁU DO

BADAŃ WIRUSOLOGICZNYCH



Materiałem do badań wirusologicznych

jest krew, surowica, kał, mocz płyn

mózgowo-rdzeniowy, wymazy z gardła,

nosa, a pośmiertnie także tkanki

narządów wewnętrznych.



Przy pobieraniu,

przechowywaniu, pracy z

materiałem wirusologicznym

należy zachować daleko idącą

ostrożność



Materiał do badań należy pobierać w

miarę możliwości jałowo, a okres między

pobraniem a badaniem powinien być jak

najkrótszy. Jeżeli istnieje podejrzenie, że

materiał jest zakażony mikroflorą

bakteryjną lub grzybami konieczne jest

usunięcie tych organizmów z próbek

stosując antybiotyki lub środki

bakteriobójcze ewentualnie

bakteriostatyczne. Należy jednak zwrócić

uwagę, że przy silnym zanieczyszczeniu

próbek stosowanie tych preparatów

mimo, że zahamuje wzrost mikroflory, to

jednak nie zobojętni ich toksyn i

produktów przemiany materii.



Istnieją także mechaniczne metody

oczyszczania próbek do badania

wirusologicznego. Polegają one na

stosowaniu filtrów- błon miliporowych z

obojętnego materiału(octan celulozy), który

nie adsorbuje wirusa, lub na wirowaniu

różnicowym. Wirowanie to usuwa bakterie i

grzyby z badanych próbek przy małej

prędkości wirowania (do3000obr./min/15min.)

Przy takich szybkościach wirowania nie

dochodzi do osadzania się wirusów.

Rodzaj materiału



Rodzaj pobieranego materiału jest

uzależniony od przebiegu choroby

oraz jej objawów klinicznych ( w

przypadku biegunek materiałem jest

kał, a np. w schorzeniach górnych

dróg oddechowych wymazy z nosa).

Pobieramy go do odpowiednich

jałowych naczyń



krew, zawartość pęcherzyków, płyn

m-r- do suchych probówek



ślinę na płytki Petriego



wycinki tkanek do butelek z płynem

konserwującym (50% glicerol w

0,85% NaCl)



popłuczyny- w kolbach Erlenmayera.



Idealnie byłoby gdyby bezpośrednio

po pobraniu materiał został poddany

badaniu. Jeżeli takiej możliwości nie

ma zachodzi potrzeba przechowania

go. Przechowuje się w stanie

zamrożenia( -25

C; - 70

C),

wyjątkiem krwi która ulega hemolizie



Jeżeli istnieje obawa kilkakrotnego

rozmrożenia i zamrożenia próbek lepiej

jest je przechowywać w temp. 4



Inna metoda przechowywania to

liofilizacja polegająca na szybkim

zamrażaniu materiału w mieszaninie

etanolu i suchego lodu, a następnie

odwodnieniu w stanie zamrożonym w

wysokiej próżni



Środki chemiczne stosowane do

konserwacji materiału biologicznego

ze względu na możliwość

toksycznego oddziaływania na

zakażane komórki lub zwierzęta, nie

znalazły zastosowania w wirusologii.

PRZYKŁADY TECHNIK POBIERANIA

MATERIAŁU DO BADAŃ

WIRUSOLOGICZNYCH



POBIERANIE ŚLINY I PLWOCINY

Pobiera je się do sterylnych naczyń ,dodaje

PBS w stosunku 3:1 i miesza bagietką.

Zawartość naczynia przenosimy do

probówek wirówkowych i odwirowujemy

3000obr przez 15 min. Następnie

dodajemy antybiotyk np. penicylinę,

streptomycynę i nystatynę, przenosimy

próbki do cieplarki i po godzinie inkubacji

zakażamy hodowle komórkowe.



POBIERANIE KAŁU



Do 5g kału dodajemy 20ml PBS

(zbuforowany r-tw. soli fizjologicznej).

Mieszamy zawiesinę i przenosimy do zlewki

z perełkami szklanymi i wstawiamy do

wytrząsarki. Następnie po 1 h. Mieszaninę

mrozimy w celu usunięcia czynników

toksycznych dla hodowli komórek do temp

–25*C, po odmrożeniu odwirujemy, a

płynem znad osadu zakażamy komórki.



BADANIE WIRUSOLOGICZNE KRWI



Krew pobiera się w sposób jałowy, można na

heparynę, wiruje, a uzyskaną plazmą zakaża

hodowle komórkowe. Można także za pomocą

mikroskopu elektronowego wykazać wirusa w

elementach morfotycznych krwi.



Do badań serologicznych pobraną krew

odwirowujemy, a uzyskaną surowicę

poddajemy inaktywacji 30min. w temp 56

mającej na celu inaktywację dopełniacza oraz

innych swoistych substancji inferujących.

Pobieranie i transport

materiału - zasady ogólne:



Materiał do badań wirusologicznych należy

pobierać we wczesnym okresie choroby, przed

podaniem choremu antybiotyków lub w 3-4 dni po

ich odstawieniu (kontrola skuteczności

antybiotykoterapii). Krew na badania serologiczne

powinna być pobrana dwukrotnie w odstępach 2-

3 tygodniowych przez wyspecjalizowana osobę.

Jeżeli materiał pobiera sam chory (mocz, kał,

plwocina) powinien zapoznać się z instrukcją

prawidłowego postępowania. Materiał należy

pobierać jałowo do wysterylizowanego pojemnika,

(jeśli to zasadne).



Transport - wszystkie materiały należy dostarczyć

do laboratorium w możliwie najkrótszym czasie,

niektóre, w zależności od czasu transportu, należy

schładzać Materiał powinien być przekazywany do

laboratorium w starannie oznaczonym pojemniku

(probówce, kałówce, pojemniku na mocz itp.)

imieniem i nazwiskiem (w przypadku pacjenta)

lub innym indywidualnym oznaczeniem (np. dla

szczepów przesyłanych do identyfikacji) wraz ze:

skierowaniem lekarskim protokołem pobrania

próbki, zleceniem, umową, dokumentem

przekazania próbki.



Dokument ten powinien (jeśli to jest zasadne i istotne dla

badania) zawierać następujące dane:



- Imię i nazwisko oraz wiek pacjenta;



- Dane zleceniodawcy



- Adres zamieszkania;



- Pieczątka zakładu kierującego i pieczątka lekarza

zlecającego;



- Wstępne rozpoznanie choroby;



- Rodzaj materiału;



- Data pobrania materiału;



- Rodzaj badania: np. bakteriologiczne, mikologiczne,

wirusologiczne, parazytologiczne, serologiczne - kierunek;



- Oczekiwania dotyczące rodzaju antybiotyków

proponowanych w leczeniu.

Pobranie wymazu z gardła

lub jamy nosowo-gardłowej



Pacjent powinien być na czczo, uprzednio

powinien przepłukać usta przegotowaną

wodą, jałowym wacikiem pobrać materiał z

migdałków, łuków podniebiennych i tylnej

ściany gardła, lub ze zmian ropnych (czopy).

Nie zanieczyszczać wymazówki śliną. W

przypadku pobierania materiału z jamy

nosowo-gardłowej należy posługiwać się

małym wacikiem na giętkim pręcie. Wacik

wprowadza się za języczkiem podniebiennym

ku górze w celu wymazania tylnej ściany

gardła.

Pobieranie wymazów z

ucha:



Skórę ucha należy uprzednio oczyścić

tamponem nasączonym 70% alkoholem

etylowym. Jałowym wacikiem (osobno do

każdego ucha) nasączonym fizjologicznym

roztworem NaCl, pobrać treść zmian ropnych.

W przypadkach zachowanej ciągłości błony

bębenkowej wymaz z przewodu słuchowego

zewnętrznego nie jest przydatny do

diagnostyki mikrobiologicznej. W przypadku

pęknięcia błony bębenkowej lub

tympanopunkcji należy pobrać treść ropną

Pobieranie wymazów z

plwociny:



Powinna być pobrana rano, na czczo, po

uprzednim umyciu zębów i przepłukaniu

ust przegotowaną wodą. Plwocinę należy

odksztuszać do jałowego pojemnika - nie

pluć. Objętość plwociny powinna wynosić

1-3 ml. Transport plwociny - do dwóch

godzin - powinien przebiegać w temp.

pokojowej, przedłużenie czasu transportu

wymaga schłodzenia materiału. Próbka

plwociny musi być dostarczona do badania

przed upływem 24 godzin.

Pobieranie wymazu z oka:



Nie pobierać w ciągu 4 godzin po płukaniu

lub podaniu środków przeciwbakteryjnych,

wydzielinę pobrać najlepiej jałową ezą i

wykonać natychmiast posiew na podłoża

bakteriologiczne. Wyjatkowo można stosować

bardzo cieniutkie wymazówki (okulistyczne) i

umieścić w podłożu transportowym.

Pobieranie wymazów grubymi wymazówkami

jak do gardła i nosa powoduje zawsze

zanieczyszczenie bakteriami ze skóry i rzęs.

Pobieranie i transport

moczu:



Należy pobrać rano, po uprzednim umyciu

okolic krocza i cewki moczowej, u mężczyzn

po odciągnięciu napletka i dokładnym

umyciu żołędzi, prącia. Mocz powinien

pochodzić ze środkowego strumienia i być

oddany w ilości około 3-5 ml. bezpośrednio

do jałowego pojemnika. We wszystkich

przypadkach wątpliwych wyników badań u

noworodków, chorych nieprzytomnych

zaleca się pobieranie moczu przez nakłucia

nadłonowe lub cewnikowanie pęcherza

moczowego. Do czasu transportu mocz

przechowywać w lodówce

Kał na badania

wirusologiczne:



Kał na badania wirusologiczne:



Należy pobrać grudkę kału wielkości

dużego orzecha laskowego do czystego

pojemnika; w przypadku silnej biegunki

około 3 ml kału płynnego. Kał należy

przed pobraniem oddać do czystego

pojemnika lub na papier, nie pobierać z

muszli klozetowej. Kał należy pobrać

trzykrotnie w odstępach 2-3 dni.

Document Outline