Biologiczne podstawy

procesów

biotechnologicznych

Pozyskiwanie

drobnoustrojów

1) Wybór miejsca i pobranie prób
2) Wstępna obróbka pobranych prób
3) Namnażanie mikroorganizmów, selekcja

i oczyszczanie w celu pozyskania
czystych kultur (wyprowadzanych z
pojedynczych komórek)

4) Określenie przydatności wyizolowanych

kultur w procesach biotechnologicznych

Pozyskiwanie szczepów

mikroorganizmów

o znaczeniu przemysłowym

Źródła pozyskiwania

szczepów przemysłowych

Izolacja gatunków mikroorganizmów dominujących w populacji

drobnoustrojów w danym środowisku nie stanowi problemu.

PROBLEM: mikroorganizmy potencjalnie przydatne w procesach

przemysłowych to tylko niewielki odsetek całej populacji.

ŹRÓDŁO SZCZEPU

ŚRODOWISKO

NATURALNE

KOLEKCJE (BANKI

SZCZEPÓW)

ŚRODOWISKO

NATURALNE

KOLEKCJA

CZYSTA KULTURA

IDENTYFIKACJA

SZCZEPÓW

HODOWLA

TESTY IN VITRO

EKSTRAKCJA, TLC,

WSTĘPNA

IDENTYFIKACJA

BIOSYNTEZA

IZOLACJA PRODUKTU

MODYFIKACJA

STRUKTUR

CHEMICZNYCH

ULEPSZENIE SZCZEPU,

OPTYMALIZACJA

PROCESU,

POWIĘKSZENIE SKALI

IDENTYFIKACJA

STRUKTUR

CHEMICZNYCH

BADANIE WŁAŚCIWOŚCI I

PRZYDATNOŚCI PRODUKTU

ZASTOSOWANIE W

PROCESACH

Screening

Skrining drobnoustrojów lub produktów

ich metabolizmu jest to szereg
selektywnych zabiegów w celu:

Wykrycie i izolację interesujących nas

mikroorganizmów

Wstępną ocenę przydatności w

procesach biotechnologicznych

Dobór mikroorganizmów (skrining)

niepatogenne
nie tworzą toksyn
stabilność biologiczna

K
o
l
e
k
c
j
e

Kolekcje szczepów:

Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN,Wrocław

ATTC (American Type Culture Collection ) Rockville, Maryland

Skrining szczepów produkcyjnych

Żródła naturalne:

wybór miejsca ( gleba zanieczyszczona, zasolone zbiorniki,
nisze ekologiczne

pobranie próbki i wstepna obróbka
- ekstrakcja solą fizjologiczna
-dodatki ( Tween, Speen)

namnażanie i selekcja czystych kultur
-skład pożywki
-pH
- temperatura
- pO2
- inhibitory selektywne
- czas hodowli
- analiza chemiczna ( chromatografia, testy barwne)

Cele skriningu

a)

Wykrycie i izolację spośród dużej liczby możliwych, tylko
tych drobnoustrojów lub metabolitów, które są celem
badań

b)

Wstępna ocena ich przydatności do danego procesu

Selekcja szczepów

• Selekcję można przeprowadzać:

– jednoetapowo-stosując testy skriningowe już podczas

izolacji kolonii

– dwuetapowo- testując wcześniej wyizolowane czyste

kultury.

Etapy skriningu

2.

Izolacja czystych kultur polega na :

–

rozcieńczeniu populacji w soli fizjologicznej lub r-rze
Ringera,

–

Posiew zawiesin na płytkach petriego z pożywką

3.

Testowanie czystych kultur

Sposoby selekcji

• Określone oddziaływanie na

środowisko przed pobraniem próby

• Zastosowanie wabików (przynęt,

pułapek)

• Wstępna obróbka fizyczna lub

mechaniczna próby

• Hodowla wzbogacająca

Metody selekcji

• Metoda płytkowa z użyciem wskaźnika- przy użyciu

odpowiednich indykatorów selekcjonuje się kolonie

wytwarzające lub przekształcające związki chemiczne.

• Metoda podwójnej hodowli na płytkach Petriego- stosowana

do selekcji szczepów produkujących antybiotyki, witaminy

czy aminokwasy.

• Metoda replik z testem auksanograficznym- służy do

selekcji kultur wytwarzających antybiotyki

• Metoda krążków agarowych- stosuje się do selekcji

szczepów produkujących antybiotyki lub syntetyzujących

aminokwasy

Metody selekcji

• Selekcja mutantów pokarmowych (auksotroficznych)-

mutanty te mogą rosnąć w pożywce minimalnej dopiero po

uzupełnieniu jej czynnikiem wzrostowym (witaminy,

aminokwasy). Dalszą selekcję prowadzi się metodą replik.

• Selekcja szczepów opornych na substancje

toksyczneselekcję przeprowadza się metodą płytek

gradientowych lub stosując zestaw płytek z różnymi

stężeniami związków toksycznych.

• Selekcja szczepów fagoodpornych- polega na obserwacjach,

z których wynika, że po infekcji i lizie fagowej komórek

bakteryjnych, pozostaje niewielka liczba przeżywających

komórek.

Czynniki selekcyjne

• Źródło węgla, azotu, fosforu
• Ksenobiotyki jako jedyne źródło węgla i energii
• Obecność określonych akceptorów elektronów
• Dodatkowe czynniki wzrostowe (aminokwasy,

witaminy)

• Czynniki biostatyczne/biobójcze (np.

Antybiotyki)

• Potencjał redox
• Temperatura, pH
• Czas hodowli

Warunki hodowli

• 4 do 15
• 42 do 100
• pH 2 do 4
• pH 8 do 9
• NaCl
• Antrazyna
• Chityna
• Azot
• kora

• Psychrofile
• Termofile
• Acidofile
• Promieniowce,grzyb

y

• Halofile, Norcardia
• Promieniowce
• Lysobacter
• beztlenowce
• Myxobacteriae

Sposoby zwiększania liczebności

poszukiwanych drobnoustrojów

Oddziaływanie na środowisko przed

pobraniem próby

Wprowadzenie

do

środowiska

wabików – pułapek

Wstępna obróbka fizyczna lub

mechaniczna próbki

Hodowla wzbogacająca

Oddziaływanie na środowisko

przed pobraniem próby

1. Wprowadzenie
środka
selekcyjnego

2. Inkubacja

Gleba

3.

Pobranie

próby

4. Posiew

Hodowla wzbogacająca

Hodowla wzbogacająca - metoda ta opiera
się na wprowadzeniu do próbki pobranej
ze środowiska związków chemicznych
mogących

pełnić

rolę

czynnika

selekcyjnego, pozwalającego na zmiany
liczebności mikroorganizmów tworzących
populację drobnoustrojów zawartych w
badanej próbce, podczas jej inkubacji w
określonych

warunkach

fizykochemicznych, tj. temperatura, czas
inkubacji.

H. wzbogacająca z zastosowaniem

podłoży wzbogacających

Gleba

1. Pobranie
próbki
środowiskowej

2. Inkubacja w
pożywce
zawierającej
czynnik
selekcyjny

3.

Posiew

Drobnoustroje przemysłowe

• Metabolit

• Amylazy

• Lipazy

• Proteazy

• Warunki

• Płytka agar/skrobia

jod

• Płytka agar/olej sole

wapniowe kwasów

• Płytka

agar/żelatyna jasne
strefy

Posiew – izolacja czystych

kultur

 Technika

seryjnych

(wielokrotnych)

rozcieńczeń (Józef Lister)

 Metoda płytkowa (Robert Koch)
• metoda rozsiewu (posiew redukcyjny, metoda

suchych rozcieńczeń)

• metoda płytek lanych
 Metoda wysiewu powierzchniowego

Metoda wysiewu powierzchniowego

Posiew redukcyjny

Test selekcyjny

 Podstawowa

metoda

identyfikacji

mikroorganizmów

wykorzystywanych

w

przemyśle

 W konstrukcji tego rodzaju testów poszukuje się

cechy biochemicznej powiązanej bezpośrednio
lub pośrednio ze zdolnością mikroorganizmu do
produkcji wybranego bioproduktu

 Obecnie dąży się do opracowania testów

selekcyjnych umożliwiających prostą i szybką
identyfikację

mikroorganizmów

o

poszukiwanych właściwościach biochemicznych

Z kolonii, które przeszły testy selekcyjne z
wynikiem pozytywnym, za pomocą posiewu
redukcyjnego zostają wyprowadzone czyste
kultury, które poddawane są następnie testom
fermentacyjnym

Testy fermentacyjne

 Pozwalają na ocenę stopnia przydatności w przemyśle

poszczególnych

izolatów

mikroorganizmów

wyselekcjonowanych w testach selekcyjnych

 Ich celem jest wybór mikroorganizmu przeprowadzającego

określony proces biotechnologiczny z największą wydajnością

po uwzględnieniu kosztów ekonomicznych związanych z

prowadzeniem procesu produkcji wybranego bioproduktu na

skalę przemysłową

 Prowadzone są w niewielkich bioreaktorach o pojemności 5-20l

 W testach tych ustala się optymalną metodę hodowli badanego

mikroorganizmu

• wybór określonego rozwiązania konstrukcyjnego bioreaktora

• wybór sposobu hodowli (ciągła, dolewowa, okresowa)

• warunki fizyko-chemiczne hodowli

• skład pożywki hodowlanej

Testowanie wszystkich kultur jest
czasochłonne i mało wydajne, dlatego
dąży się do opracowania szybkich
testów wstępnej oceny,
umożliwiających ukierunkowaną
selekcję kultur wyrastających na
odpowiednim podłożu agarowym,
charakteryzujących się korzystnymi
cechami przemysłowymi. Najczęściej
testy te opierają się na wykorzystaniu
zjawiska dyfuzji pozakomórkowych
produktów metabolizmu w podłożu
agarowym i określeniu wielkości
powstających stref ich przenikania
(przy użyciu określonych wskaźników,
specyficznych wywoływaczy lub
organizmów testowych).

Wybrane, na podstawie testów

fermentacyjnych mikroorganizmy,

zostają poddane badaniom mającym

ustalić ich przynależność gatunkową

Kilka przykładów testowania

kultur.

METODA PODWÓJNEJ

HODOWLI NA PŁYTKACH
PETRIEGO

• Do selekcji szczepów

produkujących antybiotyki,
witaminy czy aminokwasy
stosuje się metodę, w
której testowane kolonie,
wyrosłe na jednym podłożu
(A) zalewa się warstwą
innego (B), zaszczepionego
odpowiednio dobranych
organizmem testowym.

METODA KRĄŻKÓW

AGAROWYCH

• Z hodowli płytkowej

wycina się sterylnie

krążki podłoża z

testowanymi koloniami,

inkubuje się je w

warunkach dobrego

nawilżenia powietrza, a

następnie przenosi na

płytki z podłożem

zawierającym

drobnoustrój testowy

(rys. 1C.).

SELEKCJA SZCZEPÓW OPORNYCH NA

SUBSTANCJE TOKSYCZNE

• Kolonie o zwiększonej oporności na

toksyczne analogi metabolitów lub

toksyczne prekursory produktów

końcowych oraz na antybiotyki i

inne tego typu substancje można

wyselekcjonować metodą płytek

gradientowych (rys. 4.) lub stosując

zestaw płytek z różnymi stężeniami

związków toksycznych. Dzięki temu

izoluje się kolonie wyrosłe w strefie

dużego stężenia badanego związku.

Największe znaczenie metoda ta

znalazła w selekcji mutantów

regulatorowych o zniesionych lub

zmienionych mechanizmach represji

i hamowania. Z takich mutantów

można wyodrębnić wartościowe

szczepy przemysłowe

nadprodukujące aminokwasy albo

aktywnie degradujące ksenobiotyki.

Zastosowanie mutantów

w przemyśle:

• Mutanty auksotroficzne zdolne do

zwiększonej produkcji
antybiotyków

• Na drodze mutagenizacji otrzymuje się

mutanty ,które oprócz wysokiej wydajności
cechuje wybiórczość produkcji tzn. że
głównym produktem przemian jest określony
związek chemiczny ,a trudne do usunięcia
produkty uboczne wytwarzane są w ilościach
śladowych.

Posiew –

izolacja czystych kultur

•

Metoda seryjnych
(wielokrotnych) rozcieńczeń
(Józef Lister)

•

Metoda płytkowa (Robert Koch)



Metoda rozsiewu

(posiew redukcyjny)



Metoda płytek lanych



Metoda płytek
powierzchniowych

Test selekcyjny

• Podstawowa metoda identyfikacji

mikroorganizmów

wykorzystywanych w przemyśle

• W konstrukcji tego rodzaju testów

poszukuje się cechy biochemicznej

powiązanej bezpośrednio lub

pośrednio ze zdolnością

mikroorganizmu do produkcji

wybranego bioproduktu

• Obecnie dąży się do opracowania

testów selekcyjnych

umożliwiających prostą i szybką

identyfikację mikroorganizmów o

poszukiwanych właściwościach

biochemicznych

Test selekcyjny - przykłady

Poszukiwanie mikroorganizmu produkującego nowy

antybiotyk

A – zastosowanie folii półprzepuszczalnej; B – zastosowanie podwójnych płytek z
przegrodą półprzepuszczalną; C – metoda bloczków agarowych

Test selekcyjny - przykłady

Poszukiwanie mikroorganizmu odpornego na wysokie

stężenie substancji toksycznej

Metoda płytek gradientowych

Idealny mikroorganizm -

wymagania

• Mikroorganizm musi produkować interesujący

nas produkt tak szybko, jak to możliwe i jak

najprościej (tania pożywka, unikanie

kosztownych rozwiązań technologicznych)

• Musi być łatwo dostępny w postaci czystej

kultury, a co za tym idzie łatwy w

przechowywaniu przez długie okresy czasu

• Genetycznie stabilny i jednocześnie łatwo

ulegający manipulacjom genetycznym

• Łatwy w hodowli na dużą skalę na łatwo

dostępnych podłożach przemysłowych

• Nie może być organizmem patogennym !!!

Opracowanie technologii

Po wyborze mikroorganizmu producenckiego, należy

przeprowadzić żmudny proces

zwiększania skali procesu

technologicznego

– często okazuje się, że optymalne

warunki prowadzenia procesu produkcyjnego na skalę

laboratoryjną nie mają prostego przełożenia na skalę

przemysłową. W celu rozwiązania zaistniałych

problemów, należy stopniowo optymalizować proces.

Badania te pozwalają na opracowanie procesu

technologicznego zawierającego drogę prowadzącą od

pojedynczej komórki szczepu producenckiego do

biomasy dochodzącej do rzędu ton – w mikrobiologii

przemysłowej wskazane jest okresowe przeprowadzanie

powyższego szeregu czynności. Wynika to z faktu

nieuniknionych samoistnych mutacji w komórkach

potomnych szczepu producenckiego, powstałych podczas

wzrostu biomasy w bioreaktorze, co prowadzi do

obniżenia wydajności procesu produkcji.

Przechowalnictwo szczepów

• Stosowana metoda przechowalnicza powinna:

– zapewnić maksymalną przeżywalność komórek
– zminimalizować liczbę komórek uszkodzonych
– przeciwdziałać spontanicznym mutacjom i selekcji odmian

mniej przydatnych w procesie technologicznym

– ograniczyć przypadkowe zanieczyszczenia

Przechowalnictwo

szczepów.Bank czystych

kultur,kolekcja genetyczna

•

W celu maksymalnego zachowania cech biotechnologiczno-

technologicznych mikroorganizmów w przechowalnictwie

szczepów, przy wyborze metody nacisk kładzie się na:

a)

maksymalne ograniczenie liczby pasaży (przesiewów) w celu

ograniczenia możliwości wystąpienia mutacji spontanicznych

jak i mikrobiologicznego zanieczyszczenia przechowywanej,

czystej kultury

b)

maksymalne zahamowanie procesów metabolicznych na czas

przechowywania

c)

zapewnienie maksymalnej przeżywalności komórek

d)

opracowanie metody gwarantującej zachowanie jednorodności

genetycznej, stabilność bez zmian fenotypowych

e)

Metoda zapewnienia i wyjściowej charakterystyki

technologicznej szczepu

f)

łatwość uaktywnienia kultury i przygotowania materiału

posiewowego

g)

koszty

Metody:

• Pasażowanie

• Suszenie

• Liofilizacja

• Zamrażanie

pasażowanie

• Otoczki dekstranowe
• Skos agarowy (4 stopnie):

bakterie( 14 dni)
promieniowce( miesiące)

Warunki beztlenowe

zamrażanie

• Temp: -60 do – 80 stopni; -156 do –

196

• Hodowla adaptacyjna ( podwyższone

ciśnienie osmotyczne) mannitol,
sorbitol,glicerol, glikol propylenowy,
DMSO.prolina

• Odwirowanie
• Mieszanina ochronna

Adsorbcja

• Adsorbcja powierzchniowa ( szkło,

silica żel, tlenek glinowy); drożdże,
bakterie

• Kapilary ( szklane, polipropylenowe)

grzyby

• Warunki beztlenowe ( azot, argon)
• Temperatura -60 do -80 stopni
• Szybkość zamrażania 1-2 stopni/min

Liofilizacja

• Zamrożenie
• Sublimacja wody ( p=0,001 hPa)
• Czynniki ochronne
• Reselekcja klonów