Wszystkie opierają się na reakcji
pomiędzy antygenem (Ag) a
rozpoznającym go przeciwciałem (Ab)
Różnią się sposobem wykrywania
reakcji pomiędzy Ab-Ag
Aglutynacja
Hemaglutynacja
Precypitacja
Testy immunoenzymatyczne
Testy immunofluoroscencyjne
Testy radioimmunologiczne
Ag
+
Ab
= WYNIK
Wykrywają określony antygen przy
pomocy znakowanych przeciwciał.
WADA
Niskie stężenie Ag w próbie badanej
Pośrednie
Ag
+
Ab
+
Ab2 =
WYNIK
Wykrywają immunoglobuliny (Ig) które uprzednio
związały się ze swoistym antygenem.
Opierają się one na założeniu że jeśli organizm
zetknął się z danym antygenem (bakteria) to w
jego surowicy będą znajdować się swoiste wobec
tego antygenu przeciwciała (
Ab- Ig
). Dzięki
immunogennym właściwością Ig można uzyskać
przeciwciała innego gatunku(
Ab
) skierowane
przeciwko
Ab
Zachodzi pomiędzy przeciwciałami a
„upostaciowanym” antygenem. Ag
znajduje się na powierzchni kom.
procariotycznych, eucariotycznych, lub
kuleczek lateksowych.
Najbardziej efektywnymi aglutyninami
są IgM. Dla porównania cząsteczek IgG
potrzeba 100-1000x więcej.
Specyficzną odmiana aglutynacji jest
hemaglutynacja.
Erytrocyty zawieszone w roztworze soli
fizjologicznej nie zlepiają się.
Naładowana błona komórkowa (reszty
kwasu sjalowego) potraktowana
kwasem taninowym absorbuje
antygeny.
Jeśli w badanej surowicy znajdują się
przeciwciała przeciwko antygenom
obecnym na erytrocytach dochodzi do
zlepienia sie komórek - aglutynacji
Odczyn hemaglutynacji wykorzystuje
się do określenia miana przeciwciał w
surowicy badanej.
Miano przeciwciał wyznacza dodatnia
reakcja Ag-Ab w najwyższym
rozcięczeniu surowicy
Zasadą metod immunologicznych z
zastosowaniem znaczników jest
wyznakowanie jednego z reagentów
markerem. Zaletą tych metod jest
wysoka czułość
Ze względu na rodzaj użytego
znacznika metody te dzieli się na
›
Radioimmunologiczne
›
Immunoenzymatyczne
›
Immunofluorescencyjne
Metoda opracowana przez Rosalyn
Sussman Yalow
W 1977 otrzymała za swoje odkrycie
Nagrodę Nobla (wykrywanie insuliny
we krwi).
Wykorzystuje się w nich specyficzną
reakcję przeciwciał z antygenem,
otrzymując zarówno jakościowe, jak i
ilościowe dane o obecności tego
antygenu w badanej próbce w oparciu
o pomiar radioaktywności którymi
wyznakowany jest jeden z reagentów.
Wykorzystuje reakcje enzymatyczne do
uwidocznienia reakcji (ELISA)
peroksydaza chrzanowa (HRP)
fosfataza zasadowa (AP)
oksydaza glukozowa (GO)
b-D-galaktozydaza
Enzymy łączą się z białkiem
(antygenem lub przeciwciałem) za
pomocą:
aldehydu glutarowego lub nadjodanu
sodu
kompleksu enzym - antyenzym
peroksydaza - antyperoksydaza – PAP
fosfataza alkaliczna – antyfosfataza
alkaliczna -APAAP
Do zaistnienia reakcji enzymatycznej
konieczna jest obecność substratu, tj.
- nadtlenku wodoru
- chromogenu
Nadtlenek wodoru redukowany jest do
cząsteczki wody, natomiast chromogen
przekształcany jest w barwny związek,
będący widocznym produktem reakcji.
OPD – ortofenylenodiamina
pomarańczowy
DAB – 3,3-diamonobenzydyna
–
brązowy
3-amino-9-etylokarbazol
–czerwony
fast blue BB -
barwa niebieska
heksazonium fuksyny –
barwa
czerwona
5-bromo-4-chloro-3-indolilu fosforan +
błękit nitrotetrazolowy-
indygo
metsiarczan fenazyny + błękit
nitrotetrazolowy –
niebiesko
fioletowy
Fast blue + 6-bromo-2-naftyl
niebiesko
purpurowa
Fast blue + 5-bromo-4-chloroindoli
niebiesko
zielona
Opłaszczanie fazy stałej (płytki) Ag lub
Ab
Blokowanie wolnych miejsc
owoalbumina/odtłuszczone mleko
W przedstawionym powyżej teście podwójnego wiązania,
antygen po związaniu przez przeciwciała umieszczone na
płytce był wykrywany przez kolejne przeciwciało, które
związano ze znacznikiem (enzymem). Taką metodę
wykrywania antygenu, tzn. wykrywanie go za pomocą
jednego tylko przeciwciała, nazywamy bezpośrednim
testem ELISA. Zaletą tej metody jest jej szybkość w
porównaniu do przedstawionej dalej metody pośredniej.
Warto jednak zauważyć, że test bezpośredni wymaga
obecności swoistego przeciwciała, które dodatkowo musi
być wyznakowane enzymem. Zatem do wykrycia innego
antygenu trzeba przygotować kolejną porcję znakowanych
swoistych przeciwciał, co jest kosztowne i nie zawsze
możliwe do wykonania. Tych wad nie posiada test pośredni,
jest on jednak bardziej pracochłonny
W przypadku pośredniego testu ELISA przeciwciało
monoklonalne rozpoznające swoiście antygen (przeciwciało
pierwszorzędowe, ang. primary antibody) nie jest
znakowane. Znakowane jest natomiast przeciwciało
drugorzędowe (ang. secondary antibody) przyłączające się
do przeciwciała pierwszorzędowego, rozpoznające dany
izotyp
Jeżeli do wykrycia antygenu używamy swoistego
przeciwciała klasy IgG, to drugie przeciwciało musi
rozpoznawać przeciwciała klasy IgG, niezależnie od tego,
jaką wykazują one specyficzność. Zaletą tej metody jest to,
że nie trzeba znakować specyficznych względem antygenu
przeciwciał.
Wykorzystują barwniki fluoroscencyjne
FITC
– izotiocyjanian fluoresceiny
RITC
– izotiocyjanian rodaminy B
PE
– fikoerytryna (pomarańcz)
TE
– czerwień texsasu
Barwnik związany jest kowalencyjnie, a
do badania możemy użyć świeżego
materiału
Dziękuje za uwagę
