

Wszystkie opierają się na reakcji
pomiędzy antygenem (Ag) a
rozpoznającym go przeciwciałem (Ab)



Różnią się sposobem wykrywania
reakcji pomiędzy Ab-Ag



Aglutynacja



Hemaglutynacja



Precypitacja



Testy immunoenzymatyczne



Testy immunofluoroscencyjne



Testy radioimmunologiczne

= WYNIK

Wykrywają określony antygen przy
pomocy znakowanych przeciwciał.

WADA

Niskie stężenie Ag w próbie badanej

Pośrednie

Ab2 =

WYNIK

Wykrywają immunoglobuliny (Ig) które uprzednio
związały się ze swoistym antygenem.
Opierają się one na założeniu że jeśli organizm
zetknął się z danym antygenem (bakteria) to w
jego surowicy będą znajdować się swoiste wobec
tego antygenu przeciwciała (

Ab- Ig

). Dzięki

immunogennym właściwością Ig można uzyskać
przeciwciała innego gatunku(

) skierowane

przeciwko

Zachodzi pomiędzy przeciwciałami a
„upostaciowanym” antygenem. Ag
znajduje się na powierzchni kom.
procariotycznych, eucariotycznych, lub
kuleczek lateksowych.
Najbardziej efektywnymi aglutyninami
są IgM. Dla porównania cząsteczek IgG
potrzeba 100-1000x więcej.

Specyficzną odmiana aglutynacji jest
hemaglutynacja.
Erytrocyty zawieszone w roztworze soli
fizjologicznej nie zlepiają się.
Naładowana błona komórkowa (reszty
kwasu sjalowego) potraktowana
kwasem taninowym absorbuje
antygeny.

Jeśli w badanej surowicy znajdują się
przeciwciała przeciwko antygenom
obecnym na erytrocytach dochodzi do
zlepienia sie komórek - aglutynacji

Odczyn hemaglutynacji wykorzystuje
się do określenia miana przeciwciał w
surowicy badanej.
Miano przeciwciał wyznacza dodatnia
reakcja Ag-Ab w najwyższym
rozcięczeniu surowicy



Zasadą metod immunologicznych z
zastosowaniem znaczników jest
wyznakowanie jednego z reagentów
markerem. Zaletą tych metod jest
wysoka czułość



Ze względu na rodzaj użytego
znacznika metody te dzieli się na

›

Radioimmunologiczne

›

Immunoenzymatyczne

›

Immunofluorescencyjne

Metoda opracowana przez Rosalyn
Sussman Yalow
W 1977 otrzymała za swoje odkrycie
Nagrodę Nobla (wykrywanie insuliny
we krwi).

Wykorzystuje się w nich specyficzną
reakcję przeciwciał z antygenem,
otrzymując zarówno jakościowe, jak i
ilościowe dane o obecności tego
antygenu w badanej próbce w oparciu
o pomiar radioaktywności którymi
wyznakowany jest jeden z reagentów.

Wykorzystuje reakcje enzymatyczne do
uwidocznienia reakcji (ELISA)



peroksydaza chrzanowa (HRP)



fosfataza zasadowa (AP)



oksydaza glukozowa (GO)



b-D-galaktozydaza

Enzymy łączą się z białkiem
(antygenem lub przeciwciałem) za
pomocą:



aldehydu glutarowego lub nadjodanu
sodu



kompleksu enzym - antyenzym



peroksydaza - antyperoksydaza – PAP



fosfataza alkaliczna – antyfosfataza
alkaliczna -APAAP

Do zaistnienia reakcji enzymatycznej
konieczna jest obecność substratu, tj.
- nadtlenku wodoru
- chromogenu
Nadtlenek wodoru redukowany jest do
cząsteczki wody, natomiast chromogen
przekształcany jest w barwny związek,
będący widocznym produktem reakcji.



OPD – ortofenylenodiamina

pomarańczowy



DAB – 3,3-diamonobenzydyna

–

brązowy



3-amino-9-etylokarbazol

–czerwony



fast blue BB -

barwa niebieska



heksazonium fuksyny –

barwa

czerwona



5-bromo-4-chloro-3-indolilu fosforan +
błękit nitrotetrazolowy-

indygo



metsiarczan fenazyny + błękit
nitrotetrazolowy –

niebiesko

fioletowy



Fast blue + 6-bromo-2-naftyl

niebiesko

purpurowa



Fast blue + 5-bromo-4-chloroindoli

niebiesko

zielona



Opłaszczanie fazy stałej (płytki) Ag lub
Ab



Blokowanie wolnych miejsc
owoalbumina/odtłuszczone mleko

W przedstawionym powyżej teście podwójnego wiązania,
antygen po związaniu przez przeciwciała umieszczone na
płytce był wykrywany przez kolejne przeciwciało, które
związano ze znacznikiem (enzymem). Taką metodę
wykrywania antygenu, tzn. wykrywanie go za pomocą
jednego tylko przeciwciała, nazywamy bezpośrednim
testem ELISA. Zaletą tej metody jest jej szybkość w
porównaniu do przedstawionej dalej metody pośredniej.
Warto jednak zauważyć, że test bezpośredni wymaga
obecności swoistego przeciwciała, które dodatkowo musi
być wyznakowane enzymem. Zatem do wykrycia innego
antygenu trzeba przygotować kolejną porcję znakowanych
swoistych przeciwciał, co jest kosztowne i nie zawsze
możliwe do wykonania. Tych wad nie posiada test pośredni,
jest on jednak bardziej pracochłonny

W przypadku pośredniego testu ELISA przeciwciało
monoklonalne rozpoznające swoiście antygen (przeciwciało
pierwszorzędowe, ang. primary antibody) nie jest
znakowane. Znakowane jest natomiast przeciwciało
drugorzędowe (ang. secondary antibody) przyłączające się
do przeciwciała pierwszorzędowego, rozpoznające dany
izotyp

Jeżeli do wykrycia antygenu używamy swoistego
przeciwciała klasy IgG, to drugie przeciwciało musi
rozpoznawać przeciwciała klasy IgG, niezależnie od tego,
jaką wykazują one specyficzność. Zaletą tej metody jest to,
że nie trzeba znakować specyficznych względem antygenu
przeciwciał.