Slajd 1

Modyfikacja grup

funkcyjnych

Chemiczne metody identyfikacji enzymów
opierają się na modyfikacji grup funkcyjnych.

Stosuje się 2 metody:
- selektywne modyfikacje (znakowanie) grup
w centrum aktywnym
- modyfikacje z użyciem odczynników
przekształcających wszystkie dostępne
grupy funkcyjne w enzymie.

Selektywne modyfikacje

(znakowanie) grup w centrum

aktywnym

• Znakowanie substratami
• Znakowanie pseudosubstratami
• Znakowanie innymi odczynnikami

podobnymi do substratów

Affinity labelig- szczególne
powinowactwo związku
modyfikującego do miejsca
wiążącego substrat w centrum
aktywnym.

Znakowanie substratami

Metodę można stosować gdy:
- w czasie reakcji katalicznej powstaje
przejsciowo kowalencyjne wiązanie
substratu z grupą funkcyjną
- można dobrać warunki, w których rozpad
połączenia będzie zahamowany, tak by
wyodrębnić fragment łańcucha
zawierający aminokwas podstawiony przez
substrat.
Np. dla proteaz serynowo-histydynowych
połączeniem jest acyloenzym, który
powstaje w środowisku o pH 5,0.

Znakowanie substratami

Przykłady zastosowania metody:

- reakcja fosfoglukomutazy z substratem
znakowanym radioaktywnym fosforem;
podstawionym substratem jest seryna
- wykazanie obecności lizyny w centrum aktywnym
aldolaz i transaldolaz dzięki uzyskaniu stabilnych
połączeń tych enzymów z dihydroksyacetonem,
fosforanem dihydroksyacetonu i 6-fosfofruktozą
- wykazanie obecności lizyny w centrum aktywnym
dekarboksylazy acetooctanu i enzymów wiążących
fosforan pirydoksalu.

Znakowanie

pseudosubstratami

Pseudosubstrat – związek zbliżony do substratów
strukturą przestrzenna.

stabilne poł. kowalencyjne; inaktywacja enzymu

E + P

E P

kompleks modyfik. enzym

Pseudosubstraty mogą wytwarzać kompleks

tylko

z centrum aktywnym, a nie z innymi obszarami
cząsteczki enzymu.

Znakowanie

pseudosubstratami

Pseudosubstraty esteraz i
proteaz serynowych oraz
niektórych lipaz:
organiczne związki
fosforu np. DFP
(diizopropylofluorofosfora
n)

DFP fosforyluje aktywną
grupę -OH seryny w
trypsynie,
chymotrypsynie,
elastazie, plazminie i
wielu innych.

Znakowanie

pseudosubstratami

Pseudosubstratami
proteaz i esteraz
serynowo-
histydynowych
mogą być również
sulfonylofluorki.

Fenylometylosulfo-
nylofluorek: silny
inhibitor
chymotrypsyny;
sulfonuje resztę
seryny w centrum
aktywnym.

Schemat modyfikacji reszty

serylowej w cząsteczce

chymotrypsyny

pseudosubstratem

Znakowanie innymi

odczynnikami podobnymi

do substratów

Związki te cechują się odpowiednią struktura
przestrzenną, lecz łączą się z innymi
aminokwasami niż substrat i pseudosubstrat.
Tworzenie wiązania kowalencyjnego w trakcie
reakcji poprzedzone jest tworzeniem się
kompleksu odczynnika z atomami znajdującymi
się w centrum aktywnym.
Za pomocą tej metody, przy użyciu związków o
charakterze chlorometyloketonów
zidentyfikowano np. grupy czynne niektórych
proteaz.

TPCK (N-toluenosulfonylo-L-
fenyloalanina) wiąże się
nieodwracalnie z histydyną w
centrum aktywnym α-
chymotrypsyny.

TLCK (N-toluenosulfonylo-L-
lizyna) stosowana jest do
modyfikacji trypsyny.

Oba związki reagują również z
grupami sulfhydrylowymi.

Znakowanie innymi

odczynnikami podobnymi

do substratów

Do badania centrum
aktywnego α-
chymotrypsyny zastosować
można także inne związki
swoiste.

Znakowanie innymi

odczynnikami podobnymi

do substratów

Odczynnik

swoisty

Znakowana reszta

TPCK

histydyna

Chlorek

difenylokarbamylu

serylowa

α-bromoacetofenon

metionylowa

Diazooctan p-

nitrofenylu

serylowa,

histydylowa,

tyrozylowa

Odczynniki nieselektywne do

centrum aktywnego

Modyfikacja grup funkcyjnych w

enzymie  odczynnikami
nieselektywnymi  polega na tym że
reagują  ze wszystkimi dostępnymi
grupami w enzymie.

Identyfikacja grup czynnych

enzymów

Polega na badaniu zależności pomiędzy rodzajem i liczbą

zmodyfikowanych grup funkcyjnych a aktywnością enzymu.

Zależność aktywności enzymatycznej od ilości utlenionych

reszt histydylowych.

100

Liczba zmodyfikowanych reszt w czasteczce bialka

Wplyw fotooksydacji na aktywosc L-asparaginazy

Kinetyczna analiza utraty aktywności

katalitycznej towarzysząca

modyfikacji aminokwasów

-aktywność po czasie zerowym

A-aktywność po czasie t
X

– stężenie odpowiednich

aminokwasów w czasie zerowym

– stężenie odpowiednich

aminokwasów(w stanie
niemodyfikowanym) w czasie t

i k

cat

enzymów modyfikowanych

Po oznaczeniu K

i k

cat

można

roztrzygnąć jakiego rodzaju grup
czynnych dotyczy modyfikacja

Przykład: Papaina zmodyfikowana w

wyniku
działania karbodiimidu

Enzym

% aktywności Kcat (1/s)

(mol/1*10²)

Niezmodyfikow

any

100

23,1+-0,4

1,79+-0,04

Zmodyfikowany 10

2,7+-0,5

3,4+-0,8

Kontrola

101

24,1+-2,9

1,9+-0,3

Modyfikacje grup funkcyjnych

enzymów a zmiany

konformacyjne

Modyfikacje chemiczne grup funkcyjnych

powodują czasem zmiany konformacyjne
białka, dlatego też przeprowadza się
badania mające na celu ustalenie czy
białka po modyfikacji zachowują swoją
natywną konformacje. W razie
stwierdzenia jakichkolwiek zmian w
strukturze przestrzennej nie można
przypisać utraty aktywności
bezpośredniemu efektowi modyfikacji.

Ograniczenia i wskazania w

zakresie doboru odczynników:

•Modyfikacje należy przeprowadzić w warunkach, w

których nie dochodzi do denaturacji białka

•Nadmiar odczynnika jest szkodliwy
•Grupy wprowadzane do cząsteczki białka w czasie

modyfikacji powinny mieć możliwie jak najmniejszą
cząsteczkę oraz jak najmniejszy ładunek

•Odczynnik modyfikujący był możliwie selektywny
•Zmodyfikowana grupa wykazywała pochłanianie światła
•Zmodyfikowana grupa była stabilna w warunkach

hydrolizy

•Zmodyfikowana grupa daje się przeprowadzić w formę

pierwotną

Rodzaje modyfikacji

przeprowadzane za pomocą

powszechnie stosowanych

odczynników

Acylowanie - jedna z metod modyfikacji grup
aminowych. Reakcji tej ulegają ponadto grupy
hydroksylowe tyrozyny, seryny i treoniny oraz
grupy tiolowe cysteiny. Odczynniki stosowane do
acylowania różnią się strukturą i reaktywnością.

1. Reakcja modyfikowania grupy aminowej
z wykorzystaniem bezwodnika kwasu
octowego ( przy pH > 7)

Alkilowanie i arylowanie



tlenki alkilenów

 amid kwasu diazooctowego

 chlorowcopochodne kwasów alifatycznych

 N-etyloimid kwasu maleinowego

 etylenoimina

 akrylonitryle

 dinitrofluorobenzen

 bromek 2-hydroksy-5-nitrobenzylowy

Karboksyalkilowanie

3. Karboksymetylowanie grup
reaktywnych białek:

Reszty w
białku:

histydylowa metionylowa

lizylowa

tyrozylow
a

cysteilowa

a) grup tiolowych

b) grup aminowych

5. Modyfikacja grup tiolowych za pomocą
etylenoiminy

4. Modyfikacja za pomocą N-etyloimidu kwasu
maleinowego:

6. Modyfikacja akrylonitrylem:

a) Grup tiolowych

b) Grup aminowych

Reszta S-
cyjanoetylocysteilowa

Reszta N-cyjanoetylolizylowa

Utlenianie za pomocą odczynników

chemicznych

Największą wrażliwość na działanie związków
utleniających wykazują reszty:

• tryptofanylowe
• metionylowe
• cysteilowe
• tyrozylowe

Typy związków utleniających najczęściej stosowanych
do modyfikowania grup czynnych enzymów:

1.  odczynniki disulfidowe
2.  o-jodozobenzoesan
3.  N-bromoimid kwasu bursztynowego

1. Reakcja modyfikacji grup tiolowych za pomocą
kwasu 5,5-ditio-bis-2-nitrobenzoesowego (DTNB):

2. Reakcja podstawienia grup tiolowych za
pomocą disulfidu β-hydroksy-etylo-2,4-
dinitrofenylu (HEDD):

3. Utlenianie grup tiolowych o-
jodozobenzoesanem:

dinitrotiofenol

4. Utlenianie N-bromoimidem kwasu
bursztynowego:

a) reszt tryptofanylowych:

b) reszt tyrozylowych

Łańcuch peptydowy
zawierający resztę
tryptofanylową

Fragment łańcucha
peptydowego
zawierający
zmodyfikowaną
resztę tryptofanylową

Łańcuch peptydowy
zawierający resztę
tyrozylową

Fragment łańcucha
peptydowego ze
zmodyfikowaną
resztą tyrozylową

b) reszt
tyrozylowych:

Reakcje z karbodiimidami

Modyfikowanie grup karboksylowych białek
poprzez przeprowadzenie w grupy amidowe za
pomocą dwustopniowej reakcji z karbodiimidami i
aminami:

Pochodna o-
acyloizomocznika

N-acyloizomocznik

Literatura

1. „Elementy enzymologii”, Praca zbiorowa pod
redakcja Jerzego Witwickiego i Wojciecha Ardelta,
2. Źródła internetowe.

Dziękujemy za uwagę



Document Outline