PCR,

Sekwencjonowanie

Reakcja PCR

(Polymerase Chain Reaction)

•Najczulsza

metoda

służąca

do

wykrywania
i powielania fragmentów DNA o
określonej sekwencji.
•Pozwala na wykrycie i amplifikację
pojedynczej

kopii

interesującej

sekwencji
z preparatu DNA całkowitego.

Składniki mieszaniny

reakcyjnej

• Termostabilna polimeraza DNA
• Para syntetycznych

oligonukleotydów jako startery
syntezy DNA

• Trójfosforany deoksynukleotydów
• Kationy dwuwartościowe (Mg

2+

)

• Bufor o pH 8.3-8.8
• Kationy jednowartościowe (K

+

)

• Matryca DNA

Polimeraza DNA

przyłącza

nukleotydy

do końca 3’ – tzn.

katalizuje

reakcję

wydłużania

w kierunku 5’→3’

Główne etapy reakcji PCR:

•Denaturacja wyjściowych cząsteczek
DNA
•Wiązanie starterów (annealing)
•Wydłużanie łańcucha (extension)

Denaturacja

Denaturacja – rozdzielenie nici DNA pod wpływem

temperatury

Temperatura denaturacji zależy od składu zasad
fragmentu który chcemy powielić i odporności
polimerazy na wysoką temperaturę.
Najpopularniejsza polimeraza używana standartowo w
PCR – Taq wytrzymuje temperaturę 94-95 stopni C.
Przy fragmentach bogatych w GC używa się polimeraz
bardziej opornych na wysoką temperaturę (np. Pwo,
Pfu).

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

94

0

C

Pierwszy cykl

Annealing

(przyłączanie starterów)

Przyłączanie starterów (

Annealing)

Temperatura:

za wysoka – słaba wydajność

za niska - niespecyficzne powielanie

Stosuje się temperaturę około 3-5 stopni poniżej
oszacowanej temperatury topnienia.
Praktyczny wzór na temperaturę topnienia dla starterów
o długości około 20 nukleotydów:
T=2x(A+T) + 4(G+C)

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

Extension (wydłużanie łańcucha)

Wydłużanie łańcucha (Extension)

Temperatura tej części cyklu zależy od właściwości polimerazy.
Dla polimerazy Taq optymalna jest temperatura 72-78 stopni.
Szybkość reakcji w optymalnych warunkach dla polimerazy Taq
wynosi około 2000 nukleotydów/min.
Do pełnej syntezy badanego fragmentu czas trwania tego etapu
wyznaczamy zakładając połowę optymalnej prędkości.

5’

3’

3’

5’

Sekwencja startera

5’

3’

5’

3’

Sekwencja startera

Drugi cykl - denaturacja

5’

3’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

94

0

C

5’

3’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

Przyłączanie starterów

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

Wydłużanie nici (elongacja)

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

W trzecim cyklu produkowany jest

już właściwy produkt

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

PCR

>1 000 000 cząsteczek

Wzros

t

liniow

y

Wzrost

wykładnicz

y

Termostabilne polimerazy

DNA różnią się między sobą

odpornością

na wysoką temperaturę,

dokładnością wbudowywania

nukleotydów

i prędkością reakcji

Temperatura jest najważniejszym

fizycznym czynnikiem wpływającym

na wynik w reakcji PCR

PCR

Startery

1. długość 18-25 nukleotydów.
2. skład 40-60% GC.
3. nie powinny zawierać odwróconych

powtórzeń.

4.

temperatura

topnienia

podwójnoniciowej

cząsteczki

tworzonej

przez oba startery z matrycą powinna być
podobna.

5. na końcu 3’ powinny mieć G lub C,

ale nie więcej niż jeden nukleotyd.

Zbyt niska

temperatura

wiązania starterów

prowadzi do

powstania

niespecyficznych

produktów PCR

Różne odmiany

metody PCR

Analiza polimorfizmu powtarzalnych sekwencji DNA

RFLP PCR – polimorfizm długości fragmentów

restrykcyjnych

POLIMORFIZM W KODONIE 145 GENU APE1,

ROZKŁAD CZĘSTOŚCI GENOTYPÓW

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TT(Asp/Asp)

TG(Asp/Glu)

GG(Glu/Glu)

GENOTYPY

%

B

A

D

A

N

E

J

P

O

P

U

L

A

C

JI

CHORZY Z
NOWOTWORAMI
REGIONU GŁOWY I SZYI

CHORZY Z RAKIEM PŁUC

CHORZY Z RAKIEM
SZYJ KI MACICY

CHORZY Z RAKIEM
J ELITA GRUBEGO

ZDROWI

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

CHORZY NA

NOWOTWORY

REGIONU GŁOWY I

SZYI

CHORZY NA RAKA

PŁUC

CHORZY NA RAKA

SZYJ KI MACICY

CHORZY NA

NOWOTWORY

J ELITA GRUBEGO

ZDROWI

ROZKŁAD CZĘSTOŚCI ALLELI GENU 145 APE 1

Asp

Glu

Porównanie

częstości

genotypów w

stanach

patologicznych

wskazuje na

istnienie korelacji

pomiędzy pewnymi

wariantami

genetycznymi

a chorobami

Pewne allele tego samego

genu mogą być

odpowiedzialne

za wystąpienie stanów

patologicznych lub

skłonności do określonych

patologii

A. Gdowicz 2005

„Odwrócony” PCR

Używany do powielenia fragmentu o nieznanej
sekwencji, występującego w sąsiedztwie znanej
sekwencji DNA

PCR jako źródło DNA do

klonowania

Polimeraza Taq dodaje często

dodatkowy nukleotyd (A) do

końca 3’

Do

klonowania

można

wykorzystać

tzw. wektory T, które posiadają lepki
koniec

–

pojedynczy

nukleotyd

tymidynowy,

albo usunąć dodatkowy

nukleotyd A.
Można też użyć polimerazy DNA z faga
T4,
lub

polimerazy

Pfu,

a

następnie

wklonować wstawkę w zdefosforylowany
wektor o tępych końcach.

Multiplex PCR

• Wykorzystywana więcej niż jedna

para starterów.

• Pozwala

na

powielenie

kilku

fragmentów DNA w jednej reakcji.

• Warunki reakcji muszą być jednakowe

dla

wszystkich

par

starterów,

a

produkty

powinny

różnić

się

długością.

Hot start PCR

• Metoda

ułatwiająca

optymalizację

otrzymywania pożądanego fragmentu
DNA.

• Dopiero po ogrzaniu do temperatury

wyższej

niż

temperatura

niespecyficznego

wiązania

starterów

wszystkie

składniki

mieszaniny

reakcyjnej są łączone ze sobą.

• Obecnie taki efekt osiąga się przez

rozdzielenie części mieszaniny reakcyjnej
przy

pomocy

niskotopliwego wosku

(np. Ampliwax PCR Gems)

PCR dla szczególnie długich

fragmentów DNA (long PCR)

• Doskonała jakość matrycy DNA o długości

średnio powyżej 50 kb

• Mieszanina polimeraz o różnych

charakterystykach

• Dłuższe startery (24-34 pz)
• Wyższa temperatura topnienia dla starterów

(najlepiej 63-68

0

C)

• Minimalne czasy denaturacji (12 sekund) aby

uniknąć degradacji DNA

• Znacznie wydłużone czasy syntezy, zwiększające

się jeszcze wraz z ilością cykli

Zagnieżdżony (nested) PCR

Pierwsza para
starterów,
pierwsza reakcja
PCR

Druga para
starterów, druga
reakcja PCR

Mieszaniny polimeraz

• DyNAzyme

–

mieszanina

polimerazy Taq (duża szybkość

reakcji) oraz Tbr (duża dokładność)

• Taq Plus Long PCR System –

mieszanina polimerazy Taq oraz

Pfu (dobra procesywność)

Do powielania

fragmentów

metodą PCR

można użyć

zarówno DNA

jak i RNA

Sekwencjonowanie

Sekwencjonowanie

DNA

(metoda dideoxy-)

• Jest enzymatyczną reakcją
używaną

w

odczytywaniu

sekwencji nukleotydowej DNA
uprzednio sklonowanego.

• Metoda oparta jest na
użyciu

czterech

zatrzymujących

reakcję

wydłużania

łańcucha

nukleotydów, które w pozycji
3’ mają H zamiast OH (di-
deoxy: ddATP, ddGTP, ddCTP,
ddTTP).

•W klasycznej metodzie każdy
nukleotyd

dodawany

jest

oddzielnie

do

czterech

prowadzonych

równolegle

reakcji replikacji DNA.

•Produkty

tych

czterech

reakcji są rozdzielane metodą
elektroforezy
w żelu poliakrylamidowym

Nukleotydy dideoxy- powodują
zakończenie replikacji DNA

Sekwencjonowanie

DNA

C

G

Znakowanie
sekwencjonowane
go

fragmentu

pojedynczym
nukleotydem

Znakowanie końcowego

nukleotydu (dideoxy)

Odczytywanie sekwencji DNA

Metoda chemiczna sekwencjonowania polega na

wykorzystaniu specyficznych wobec

poszczególnych zasad reakcji chemicznych, co

pozwala na identyfikację miejsca występowania

danej zasady

Zasada

Specyficzna modyfikacja

G

Metylacja N7 dimetylosiarczanem w pH 8.0
sprawia, że wiązanie C8-C9 staje się specyficznie
wrażliwe na rozkład przy pomocy zasady.

A+G

Mrówczan piperydyny w pH 2.0 osłabia wiązania
glikozydowe puryn, co powoduje depurynację

C+T

Hydrazyna otwiera pierścień pirymidynowy, który

następnie recyklizuje w formę podatną na
usunięcie

C

W obecności 1.5 M NaCl jedynie cytozyna reaguje
specyficznie z hydrazyną

A>C

1.2 N NaOH w temp. 90

0

C powoduje częste

przecinanie reszt A i rzadsze - C

Piperydyna przecina łańcuch fosfocukrowy w miejscu modyfikacji zasady

Odczytywanie sekwencji

Specyficzne znakowanie jednej

nici DNA przy użyciu fragmentu

Klenowa polimerazy I

Sekwencjonowanie automatyczne
W systemie tym stosuje się nukleotydy dideoxy lub startery
znakowane czterema różnymi znacznikami fluorescencyjnymi.
Można stosować sekwencjonowanie rozpoczynające się od jednego
startera
i zatrzymujące się na znakowanych nukleotydach dideoxy.
Wszystkie cztery znakowane nukleotydy dideoxy występują wtedy
w jednej mieszaninie.
Inną możliwością jest stosowanie znakowanych starterów,
prowadzenie czterech niezależnych reakcji, a następnie rozdział na
jednej ścieżce żelu. Po reakcji mieszanina nanoszona jest na żel
poliakrylamidowy,
a elektroforeza prowadzona jest w aparacie wyposażonym w
detektor promieniowania.

System

ABI

(Applied

Biosystems

Incorporated)

używa

czterech

znakowanych

fluorescencyjnymi

barwnikami

ddNTPs

i polimerazy Taq

(AmpliTaq).

Wzbudzanie fluorochromów i detekcja emisji
mają miejsce w określonej pozycji w pobliżu
dolnej części żelu. Dane są odczytywane na
podstawie spektrum emisyjnego kolejnych pasm
mijających

detektor

w czasie elektroforezy. Dane przekazywane są
do komputera podłączonego do urządzenia

.

Sekwencjonowanie cykliczne

(połączenie metody PCR i

sekwencjonowania) pozwala

na liniową amplifikację sygnału

Enzymy używane

do sekwencjonowania

Sekwenaza

-

zmodyfikowana

wersja

polimerazy bakteriofaga T7, nie mająca
aktywności 3’-5’ egzonukleazy. Wydajne
włączanie

dideoksy-nukleotydów

zapewnia

obecność

tyrozyny

w pozycji 667 enzymu.

Termostabilne zmodyfikowane polimerazy
- AmpliTaqFS (fluorescent sequencing)
Taquenase
ThermoSequenase

Budowa polimeraz wykorzystywanych

w sekwencjonowaniu

Kompresja w żelu

7-deaza-dGTP

dITP

Sekwencjonowanie długich

fragmentów DNA – metoda

shotgun

Etapy

sekwencjonowania

1. Oczyszczanie DNA z wektora o dużej pojemności (kosmid,

BAC itp.)

2. Ligacja wewnątrzcząsteczkowa (cyrkularyzacja)
3. Rozrywane cząsteczek DNA na fragmenty (sonikowanie,

nebulizacja, trawienie Dnazą I w obecności Mn

2+

)

4. Naprawa końców DNA:

polimeraza faga T4
fragment Klenowa polimerazy I DNA
kinaza polinukleotydowa faga T4

5. Frakcjonowanie fragmentów DNA w żelu agarozowym

lub poliakrylamidowym

6. Ligacja z wektorem M13, transformacja bakterii
7. Izolacja poszczególnych klonów na płytkę mikrotitracyjną
8. Sekwencjonowanie przy użyciu uniwersalnego startera
9. Komputerowe składanie sekwencji we właściwej

kolejności

Na ćwiczenie 2 proszę przygotować:
1. budowa komórek prokariotycznych i eukariotycznych.
2. zadania z rozcieńczeń roztworów
Na ćwiczenie 3:
1. budowa DNA i zasad azotowych
2. instrukcja do ćwiczeń – działanie odczynników
w izolacji DNA (wstęp teoretyczny)