Metody badania

Metody badania

drobnoustrojów

drobnoustrojów

Metody mikrobiologiczne, stosowane na

Metody mikrobiologiczne, stosowane na

potrzeby mikrobiologii żywności, mają na

potrzeby mikrobiologii żywności, mają na

celu:

celu:

- wykrywanie grup drobnoustrojów

- wykrywanie grup drobnoustrojów

pożytecznych i szkodliwych, obecnych w

pożytecznych i szkodliwych, obecnych w

badanych produktach spożywczych;

badanych produktach spożywczych;

- określenie liczby drobnoustrojów

- określenie liczby drobnoustrojów

występujących w surowcach, półproduktach i

występujących w surowcach, półproduktach i

wyrobach gotowych;

wyrobach gotowych;

- kierowanie i analizowanie przebiegu

- kierowanie i analizowanie przebiegu

procesów technologicznych produkcji

procesów technologicznych produkcji

artykułów żywnościowych, w których zostają

artykułów żywnościowych, w których zostają

wykorzystane właściwości fizjologiczne i

wykorzystane właściwości fizjologiczne i

biochemiczne drobnoustrojów.

biochemiczne drobnoustrojów.

W badaniach mikrobiologicznych

W badaniach mikrobiologicznych

wyróżnia się:

wyróżnia się:

metody mikroskopowe

metody mikroskopowe

i metody hodowlane.

i metody hodowlane.

W metodach mikroskopowych

W metodach mikroskopowych

zasadniczym przyrządem jest mikroskop,

zasadniczym przyrządem jest mikroskop,

a w metodach hodowlanych stosuje się

a w metodach hodowlanych stosuje się

pożywki (podłoża), na których następuje

pożywki (podłoża), na których następuje

intensywne rozmnażanie się badanych

intensywne rozmnażanie się badanych

organizmów.

organizmów.

Pobieranie próbek do analizy

Pobieranie próbek do analizy

mikrobiologicznej

mikrobiologicznej

Badana próbka może stanowić

Badana próbka może stanowić

podstawę do oceny produktu, gdy ma

podstawę do oceny produktu, gdy ma

ten sam skład i właściwości, co cała

ten sam skład i właściwości, co cała

partia produktu.

partia produktu.

Pobieranie próbek przeprowadza się

Pobieranie próbek przeprowadza się

według obowiązującej normy

według obowiązującej normy

najczęściej metodą „na ślepo" (bez

najczęściej metodą „na ślepo" (bez

wyboru). Zgodnie z tą metodą próbki

wyboru). Zgodnie z tą metodą próbki

pierwotne pobiera się z różnych

pierwotne pobiera się z różnych

miejsc partii produktu - z wierzchu, ze

miejsc partii produktu - z wierzchu, ze

środka i spodu. Suma

środka i spodu. Suma

próbek

próbek

pierwotnych

pierwotnych

stanowi

stanowi

próbkę ogólną

próbkę ogólną

z

z

której z kolei, przez odpowiednie

której z kolei, przez odpowiednie

zmniejszenie, otrzymuje się

zmniejszenie, otrzymuje się

próbkę

próbkę

średnią

średnią

.

.

Badaniom mikrobiologicznym poddaje

Badaniom mikrobiologicznym poddaje

się zwykle oddzielnie każdą

się zwykle oddzielnie każdą

próbkę

próbkę

pierwotną.

pierwotną.

Poszczególne próbki bada się od razu

Poszczególne próbki bada się od razu

po pobraniu lub, w wyjątkowych

po pobraniu lub, w wyjątkowych

przypadkach, przechowuje się je

przypadkach, przechowuje się je

okresowo w warunkach określonych w

okresowo w warunkach określonych w

normach.

normach.

Barwienie preparatów mikroskopowych

Barwienie preparatów mikroskopowych

metodą Grama

metodą Grama

W metodzie tej wykorzystuje się zjawisko

W metodzie tej wykorzystuje się zjawisko

powstawania w komórkach niektórych

powstawania w komórkach niektórych

bakterii pod wpływem roztworu fioletu

bakterii pod wpływem roztworu fioletu

krystalicznego i płynu Lugola trwałych

krystalicznego i płynu Lugola trwałych

związków o barwie fioletowej,

związków o barwie fioletowej,

nierozpuszczalnych w alkoholu. Bakterie

nierozpuszczalnych w alkoholu. Bakterie

wykazujące tę właściwość określa się jako

wykazujące tę właściwość określa się jako

Gram-dodatnie (G+).

Gram-dodatnie (G+).

W komórkach innych gatunków bakterii

W komórkach innych gatunków bakterii

powstałe związki są nietrwałe i wymywają się

powstałe związki są nietrwałe i wymywają się

alkoholem. Bakterie te odbarwiają się pod

alkoholem. Bakterie te odbarwiają się pod

wpływem alkoholu, a następnie barwią się na

wpływem alkoholu, a następnie barwią się na

czerwono po dobarwieniu preparatu fuksyną i

czerwono po dobarwieniu preparatu fuksyną i

są określane jako Gram-ujemne (G-).

są określane jako Gram-ujemne (G-).

Zasady przygotowywania rozcieńczeń

Zasady przygotowywania rozcieńczeń

z produktów spożywczych

z produktów spożywczych

Produkty spożywcze są w różnym stopniu

Produkty spożywcze są w różnym stopniu

zakażone. W celu oznaczenia w nich ogólnej

zakażone. W celu oznaczenia w nich ogólnej

liczby drobnoustrojów lub wykrycia określonej

liczby drobnoustrojów lub wykrycia określonej

grupy, próbkę pobraną do badań

grupy, próbkę pobraną do badań

mikrobiologicznych należy najpierw

mikrobiologicznych należy najpierw

odpowiednio rozcieńczyć tak, aby wysiewany

odpowiednio rozcieńczyć tak, aby wysiewany

na pożywkę badany materiał umożliwiał

na pożywkę badany materiał umożliwiał

ilościowe określenie wzrostu.

ilościowe określenie wzrostu.

Produkty spożywcze rozcieńcza się płynem

Produkty spożywcze rozcieńcza się płynem

Ringera lub roztworem fizjologicznym z

Ringera lub roztworem fizjologicznym z

peptonem.

peptonem.

Schemat przygotowania rozcieńczeń do

Schemat przygotowania rozcieńczeń do

posiewu

posiewu

10 g lub 10

cm

3

badanego

produktu

1
cm

3

1
cm

3

1
cm

3

1
cm

3

Zasada oznaczania ogólnej liczby

Zasada oznaczania ogólnej liczby

drobnoustrojów

drobnoustrojów

metodą płytkową

metodą płytkową

Metoda płytkowa jest jedną z

Metoda płytkowa jest jedną z

najstarszych metod hodowania

najstarszych metod hodowania

drobnoustrojów. Została ona

drobnoustrojów. Została ona

wprowadzona przez R. KOCHA i jest

wprowadzona przez R. KOCHA i jest

obecnie powszechnie stosowana w

obecnie powszechnie stosowana w

badaniach ilościowych i jakościowych.

badaniach ilościowych i jakościowych.

Metodą tą oznacza się

Metodą tą oznacza się

wyłącznie komórki

wyłącznie komórki

żywe.

żywe.

Technika badań ilościowych metodą

Technika badań ilościowych metodą

płytkową polega na posiewie do jałowych

płytkową polega na posiewie do jałowych

płytek Petriego określonej ilości badanego

płytek Petriego określonej ilości badanego

materiału i zalaniu odpowiednią pożywką.

materiału i zalaniu odpowiednią pożywką.

Zawartość płytek miesza się dokładnie i

Zawartość płytek miesza się dokładnie i

pozostawia w spokoju aż do zestalenia

pozostawia w spokoju aż do zestalenia

pożywki.

pożywki.

Rozcieńczenia 10

Równolegle z posiewem próbki powinno

Równolegle z posiewem próbki powinno

się też wykonać:

się też wykonać:

-

próby kontrolne z samą pożywką,

próby kontrolne z samą pożywką,

-

z pożywką zaszczepioną 1 cm

z pożywką zaszczepioną 1 cm

3

3

płynu do

płynu do

rozcieńczeń.

rozcieńczeń.

Następnie płytki z posiewami umieszcza

Następnie płytki z posiewami umieszcza

się dnem do góry w cieplarce i po

się dnem do góry w cieplarce i po

określonym czasie hodowli oblicza się

określonym czasie hodowli oblicza się

liczbę kolonii wyrosłych na pożywce.

liczbę kolonii wyrosłych na pożywce.

W metodzie płytkowej zakłada się, że

W metodzie płytkowej zakłada się, że

każda kolonia powstaje z jednej komórki

każda kolonia powstaje z jednej komórki

i że każda żywa komórka jest w stanie

i że każda żywa komórka jest w stanie

rozmnożyć się i utworzyć kolonię.

rozmnożyć się i utworzyć kolonię.

Metoda płytkowa jest metodą

Metoda płytkowa jest metodą

porównawczą, za pomocą której określa

porównawczą, za pomocą której określa

się liczbę żywych komórek

się liczbę żywych komórek

drobnoustrojów w określonych

drobnoustrojów w określonych

warunkach hodowli.

warunkach hodowli.

Do oznaczania

Do oznaczania

ogólnej liczby

ogólnej liczby

drobnoustrojów

drobnoustrojów

stosuje się najczęściej

stosuje się najczęściej

agar odżywczy, agar odżywczy z

agar odżywczy, agar odżywczy z

glukozą lub agar odżywczy z mlekiem i

glukozą lub agar odżywczy z mlekiem i

glukozą.

glukozą.

Hodowlę prowadzi się zwykle w temp.

Hodowlę prowadzi się zwykle w temp.

30°C w czasie 72 h.

30°C w czasie 72 h.

W tych warunkach na pożywce rosną

W tych warunkach na pożywce rosną

głównie drobnoustroje mezofilne

głównie drobnoustroje mezofilne

tlenowe (są to bakterie, drożdże i

tlenowe (są to bakterie, drożdże i

pleśnie).

pleśnie).

Zasada oznaczania obecności bakterii

Zasada oznaczania obecności bakterii

z grupy coli metodą wskaźnikową

z grupy coli metodą wskaźnikową

Oznaczanie obecności bakterii z grupy coli

Oznaczanie obecności bakterii z grupy coli

jest

jest

badaniem jakościowym.

badaniem jakościowym.

Celem tych

Celem tych

badań jest wykrycie obecności bakterii z

badań jest wykrycie obecności bakterii z

grupy pałeczki okrężnicy

grupy pałeczki okrężnicy

(Escherichia coli),

(Escherichia coli),

co

co

wskazuje na zanieczyszczenie kałowe

wskazuje na zanieczyszczenie kałowe

produktu. Są to wprawdzie przeważnie

produktu. Są to wprawdzie przeważnie

bakterie nieszkodliwe dla zdrowia, ale ich

bakterie nieszkodliwe dla zdrowia, ale ich

obecność pozwala podejrzewać, że w

obecność pozwala podejrzewać, że w

badanym produkcie mogą być również obecne

badanym produkcie mogą być również obecne

bakterie chorobotwórcze przewodu

bakterie chorobotwórcze przewodu

pokarmowego, wywołujące takie choroby jak:

pokarmowego, wywołujące takie choroby jak:

dur brzuszny, czerwonkę i inne.

dur brzuszny, czerwonkę i inne.

Z punktu widzenia higieniczno-

Z punktu widzenia higieniczno-

sanitarnego samo stwierdzenie

sanitarnego samo stwierdzenie

obecności bakterii z grupy pałeczki

obecności bakterii z grupy pałeczki

okrężnicy nie jest wystarczające.

okrężnicy nie jest wystarczające.

Trzeba je określić również ilościowo.

Trzeba je określić również ilościowo.

Oznaczanie ilościowe polega na

Oznaczanie ilościowe polega na

wykryciu tych bakterii w określonej

wykryciu tych bakterii w określonej

ilości produktu, przy czym im

ilości produktu, przy czym im

mniejsza będzie ilość badanej próbki,

mniejsza będzie ilość badanej próbki,

w której stwierdza się jeszcze

w której stwierdza się jeszcze

obecność tych bakterii, tym produkt

obecność tych bakterii, tym produkt

jest bardziej niebezpieczny dla

jest bardziej niebezpieczny dla

zdrowia.

zdrowia.

Obecność pałeczek okrężnicy

Obecność pałeczek okrężnicy

wykrywa się metodą hodowlaną w

wykrywa się metodą hodowlaną w

pożywce płynnej (np. pożywka z

pożywce płynnej (np. pożywka z

laktozą, żółcią i zielenią brylantową).

laktozą, żółcią i zielenią brylantową).

Wykorzystuje się przy tym zdolność

Wykorzystuje się przy tym zdolność

tych bakterii do fermentacji laktozy z

tych bakterii do fermentacji laktozy z

wytworzeniem gazu. Gaz ten zbiera

wytworzeniem gazu. Gaz ten zbiera

się w specjalnych probówkach

się w specjalnych probówkach

Diirhama zanurzonych do pożywki.

Diirhama zanurzonych do pożywki.

Prowadzenie hodowli

Prowadzenie hodowli

drobnoustrojów oraz interpretacja

drobnoustrojów oraz interpretacja

wyników badań

wyników badań

W badaniach hodowlanych określa się:

W badaniach hodowlanych określa się:

-

wygląd kolonii na pożywce stałej

wygląd kolonii na pożywce stałej

(wielkość, kształt, barwę);

(wielkość, kształt, barwę);

-

charakterystyczne zmiany w pożywce

charakterystyczne zmiany w pożywce

płynnej (zmętnienie pożywki, tworzenie

płynnej (zmętnienie pożywki, tworzenie

się osadu, kożuszka, wytwarzanie się

się osadu, kożuszka, wytwarzanie się

gazów);

gazów);

-

charakterystyczne zmiany w pożywce

charakterystyczne zmiany w pożywce

stałej (rozpłynnianie pożywki, rozwój na

stałej (rozpłynnianie pożywki, rozwój na

powierzchni lub w głębi);

powierzchni lub w głębi);

- inne cechy, jak np.: wpływ odczynu

- inne cechy, jak np.: wpływ odczynu

pożywki lub temperatury hodowli na

pożywki lub temperatury hodowli na

szybkość wzrostu drobnoustrojów albo

szybkość wzrostu drobnoustrojów albo

zmiany chemiczne w pożywce na

zmiany chemiczne w pożywce na

skutek oddziaływania drobnoustrojów

skutek oddziaływania drobnoustrojów

na określone składniki pożywki (np.

na określone składniki pożywki (np.

białko, cukry).

białko, cukry).

Hodowlę (inkubację) drobnoustrojów

Hodowlę (inkubację) drobnoustrojów

prowadzi się na zaszczepionych

prowadzi się na zaszczepionych

pożywkach w cieplarce o stałej

pożywkach w cieplarce o stałej

temperaturze optymalnej dla ich

temperaturze optymalnej dla ich

wzrostu.

wzrostu.

Po zakończeniu inkubacji dokonuje się

Po zakończeniu inkubacji dokonuje się

obserwacji wzrostu drobnoustrojów i

obserwacji wzrostu drobnoustrojów i

opisuje wyniki. Na podstawie wyników

opisuje wyniki. Na podstawie wyników

dokonuje się oceny badanych

dokonuje się oceny badanych

produktów, porównując te wyniki z

produktów, porównując te wyniki z

wymaganiami w normach

wymaganiami w normach

przedmiotowych.

przedmiotowych.

Charakter wzrostu drobnoustrojów

Charakter wzrostu drobnoustrojów

na pożywkach stałych:

na pożywkach stałych:

a-g) wzniesienia kolonii (a - płaska,

a-g) wzniesienia kolonii (a - płaska,

b - wzniesiona, c - lekko

b - wzniesiona, c - lekko

soczewkowata, d - wypukła, e -

soczewkowata, d - wypukła, e -

wzniesiona ze ściętym

wzniesiona ze ściętym

wierzchołkiem, f- z wzniesionym

wierzchołkiem, f- z wzniesionym

środkiem, g - brodawkowata);

środkiem, g - brodawkowata);

h-o) brzegi kolonii (h - równy, i -

h-o) brzegi kolonii (h - równy, i -

falisty, j - płatowaty, k -

falisty, j - płatowaty, k -

karbowany, l - ząbkowany, m -

karbowany, l - ząbkowany, m -

promienisty z brzegiem

promienisty z brzegiem

płatowatym, n - rozgałęziony, o -

płatowatym, n - rozgałęziony, o -

korzonkowaty);

korzonkowaty);

p-s) wzrost na agarze skośnym, (p

p-s) wzrost na agarze skośnym, (p

- nitkowaty, q - lekko

- nitkowaty, q - lekko

rozprzestrzeniający się z brzegiem

rozprzestrzeniający się z brzegiem

falistym, r - rozprzestrzeniający się

falistym, r - rozprzestrzeniający się

z brzegiem ząbkowanym, s -

z brzegiem ząbkowanym, s -

rozprzestrzeniający się);

rozprzestrzeniający się);

t-y) wzrost na żelatynie kłutej (t -

t-y) wzrost na żelatynie kłutej (t -

bez upłynnienia, u - kraterowe

bez upłynnienia, u - kraterowe

upłynnienie, v - workowate, w -

upłynnienie, v - workowate, w -

lejkowate, x - walcowate, y -

lejkowate, x - walcowate, y -

kielichowate)

kielichowate)

Podstawy nowoczesnych

Podstawy nowoczesnych

systemów

systemów

zagwarantowania jakości

zagwarantowania jakości

żywności

żywności

Pojęcie „zapewnienie jakości" (ang.

Pojęcie „zapewnienie jakości" (ang.

quality assurance - QA) zostało

quality assurance - QA) zostało

zdefiniowane według normy PN-ISO

zdefiniowane według normy PN-ISO

8402, jako:

8402, jako:

„

„

Wszystkie planowane i systematyczne,

Wszystkie planowane i systematyczne,

a także jeśli to konieczne, udowodnione

a także jeśli to konieczne, udowodnione

działania realizowane w ramach

działania realizowane w ramach

systemu jakości, służące do wzbudzenia

systemu jakości, służące do wzbudzenia

należytego zaufania co do tego, że

należytego zaufania co do tego, że

obiekt spełni wymagania jakościowe".

obiekt spełni wymagania jakościowe".

Żywność gwarantowanej jakości

Żywność gwarantowanej jakości

to żywność, dla której w całym procesie

to żywność, dla której w całym procesie

pozyskiwania, przetwórstwa i

pozyskiwania, przetwórstwa i

dystrybucji, aż do nabywcy,

dystrybucji, aż do nabywcy,

zastosowano systemy gwarantujące

zastosowano systemy gwarantujące

spełnienie ustalonych wymagań

spełnienie ustalonych wymagań

jakościowych, co umożliwia uzyskanie

jakościowych, co umożliwia uzyskanie

wyrobu o założonych (oczekiwanych)

wyrobu o założonych (oczekiwanych)

parametrach.

parametrach.

W ostatnich latach, w krajach wysoko

W ostatnich latach, w krajach wysoko

uprzemysłowionych, opracowano i

uprzemysłowionych, opracowano i

częściowo wdrożono różne systemy

częściowo wdrożono różne systemy

kształtowania jakości.

kształtowania jakości.

Jednym z nich jest

Jednym z nich jest

system HACCP

system HACCP

(Hazard Analysis and Critical Control

(Hazard Analysis and Critical Control

Points - Analizy zagrożeń i krytycznych

Points - Analizy zagrożeń i krytycznych

punktów kontrolnych),

punktów kontrolnych),

umożliwiający

umożliwiający

aktywną kontrolę jakości produktów.

aktywną kontrolę jakości produktów.

System HACCP

System HACCP

jest to system krytycznych punktów

jest to system krytycznych punktów

kontroli ustalonych na podstawie

kontroli ustalonych na podstawie

analizy zagrożeń, w którym

analizy zagrożeń, w którym

bezpieczeństwo osiąga się przez

bezpieczeństwo osiąga się przez

zapobieganie zagrożeniom w całym

zapobieganie zagrożeniom w całym

łańcuchu żywnościowym.

łańcuchu żywnościowym.

System HACCP

System HACCP

umożliwia zlokalizowanie miejsc skażeń

umożliwia zlokalizowanie miejsc skażeń

i niepożądanych zmian jakości produktu

i niepożądanych zmian jakości produktu

w istniejących procesach

w istniejących procesach

przetwórczych.

przetwórczych.

Zastosowany na etapie projektowania,

Zastosowany na etapie projektowania,

tworzy warunki produkcji o minimalnym

tworzy warunki produkcji o minimalnym

prawdopodobieństwie wytworzenia

prawdopodobieństwie wytworzenia

żywności o niedostatecznej jakości.

żywności o niedostatecznej jakości.

HACCP jest stosowany do eliminowania ryzyka

HACCP jest stosowany do eliminowania ryzyka

dotyczącego biologicznych, chemicznych i

dotyczącego biologicznych, chemicznych i

fizycznych zanieczyszczeń żywności, w tym

fizycznych zanieczyszczeń żywności, w tym

m.in.:

m.in.:

-

bakteriami chorobotwórczymi (

bakteriami chorobotwórczymi (

Salmonella,

Salmonella,

Shigella

Shigella

, gronkowce,

, gronkowce,

Clostridium botulinum,

Clostridium botulinum,

Clostridium perfringens, Escherichia coli,

Clostridium perfringens, Escherichia coli,

Bacillus cereus, Listeria monocytogenes

Bacillus cereus, Listeria monocytogenes

) i

) i

pleśniami toksynogennymi,

pleśniami toksynogennymi,

-

czynnikami chemicznymi (toksyny,

czynnikami chemicznymi (toksyny,

aflatoksyny, azotyny, metale ciężkie,

aflatoksyny, azotyny, metale ciężkie,

pozostałości pestycydów),

pozostałości pestycydów),

- zanieczyszczeniami mechanicznymi

- zanieczyszczeniami mechanicznymi

(kamienie, szkło, kawałki metali).

(kamienie, szkło, kawałki metali).

Zasady i etapy wprowadzania HACCP

Zasady i etapy wprowadzania HACCP