PCR

PCR

Garść informacji

Garść informacji

PCR ang. łańcuchowa reakcja polimerazy (polimerazy
DNA to enzymy syntetyzujące DNA)

PCR umożliwia szybkie powielenie

niemal dowolnego fragmentu DNA

niemal dowolną liczbę razy

Jest jedną z podstawowych i absolutnie niezastąpionych
technik we współczesnym laboratorium biologicznym

To, co najważniejsze

To, co najważniejsze

Polimeraza DNA:

Polimeraza DNA:

• Porusza się tylko w jednym kierunku (5’->3’)
• Do rozpoczęcia syntezy potrzebuje tzw. startera

Startery:

Startery:

• Umożliwiają precyzyjny wybór miejsca, od którego

polimeraza rozpoczyna syntezę nowego łańcucha

5

5

3

3

PCR-kontrolowana

PCR-kontrolowana

replikacja określonego

replikacja określonego

fragmentu DNA

fragmentu DNA

Starte
ry
RNA

Kierunek
replikacji

Siostrzane nici
DNA

Nowe nici
DNA

Replikacja

(wszystkie etapy

przeprowadzają

enzymy)

PCR

(tylko wydłużanie

zależne od enzymu)

94ºC

66ºC

72ºC

20-35 cykli

Denaturacja

Denaturacja – nici
DNA rozłączają się pod
wpływem temperatury

Przyłączanie

Przyłączanie starterów
– temperatura zależy od
ich długości i sekwencji

Wydłużanie

Wydłużanie –
polimeraza Taq
dobudowuje
komplementarną
sekwencję

Przede wszystkim temperatura

Przede wszystkim temperatura

To, co najważniejsze

To, co najważniejsze

• Bakteria

T

hermus

aq

uaticus żyje w gorących źródłach

• Optymalna temp. polimerazy Taq to 72ºC
• Polimeraza Taq nie degraduje w temp. ~95ºC

Dzięki temu nie trzeba dodawać nowej polimerazy

w każdym cyklu PCR 

Zalety:

Zalety:

• bardzo wysoka czułość 
• szybkość 
• prostota 

Zalety i wady PCR

Zalety i wady PCR

Wady:

Wady:

• bardzo wysoka czułość 

Dlatego konieczne są odpowiednie

kontrole

czystości reakcji i jej prawidłowego przebiegu

Najważniejsze są kontrole!!!

Najważniejsze są kontrole!!!

Kontrola pozytywna (+):

Kontrola pozytywna (+):

• próbka, o której wiemy na pewno, że w danych

warunkach reakcji da odpowiedni produkt

Kontrola negatywna (-):

Kontrola negatywna (-):

• próbka, z której, przy zachowaniu właściwej

czystości pracy, nie powstanie

żaden produkt

Najważniejsze są kontrole!!!

Najważniejsze są kontrole!!!

Bufor, nukleotydy,
startery, polimeraza,
woda

We wszystkich probówkach
jest taka sama mieszanina
do PCR, różnią się więc
tylko DNA

A

B

+

-

kontrole:

Wyniki:

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

+

-

+

+

+

-

PCR to on: Kary Mullis

PCR to on: Kary Mullis

W 1993 roku przyznano mu
Nagrodę Nobla z chemii

Firma Roche odkupiła od
Cetus Corp. prawa do PCR
za 300 mln $ (i ma je do
dzisiaj)

Kary Mullis otrzymał od
firmy premię 10 tys. $

ELEKTROFOREZA

ELEKTROFOREZA

• Elektroforeza to sposób rozdziału fragmentów DNA

zależnie od ich długości

• Ruch cząsteczek w żelu agarozowym następuje pod

wpływem prądu elektrycznego

• Cząsteczki DNA poruszają się w polu elektrycznym,

ponieważ są obdarzone ładunkiem

• Sam rozdział następuje dzięki właściwościom żelu

Garść informacji

Garść informacji

Elektroforeza DNA

Elektroforeza DNA

Z tych glonów (różne gatunki
krasnorostów)
pochodzi ten związek
(agaroza)

Agaroza rozpuszcza się w gorącej wodzie i usieciowuje
– powstaje stały żel, w którym włókna agarozy tworzą
siateczkę, przez której oczka będzie „przeciskać się”
DNA

Im mniejsze i krótsze fragmenty
DNA, tym łatwiej i szybciej będą
migrować w żelu – tym dłuższą
drogę przebędą w danym czasie

Jak to działa?

Jak to działa?

+

-

No ale gdzie to DNA???

No ale gdzie to DNA???

Bromek wchodzi między

płasko położone jedne nad

drugimi nukleotydy i wiąże się

z zasadami azotowymi,

zaburzając strukturę DNA

Wzbudzony światłem UV,

bromek świeci na pomarańczowo

KONIEC

KONIEC



