Łańcuchowa

reakcja

polimeryzacji

(PCR)

Maciej Lendzioszek gr 14a

Składniki mieszaniny

reakcyjnej

• matrycowe DNA (lub mRNA, jeśli stanowi matrycę)
• trifosforany deoksyrybonukleozydów (dNTP)
• startery (primery)
• termostabilna polimeraza DNA
• Kationy dwuwartościowe (Mg2+)
• Kationy jednowartościowe (K+)
• Bufor o pH 8.3-8.8
• inne składniki

Etapy reakcji PCR

• Denaturacja wyjściowych cząsteczek DNA
• Wiązanie starterów (annealing)
• Wydłużanie nici DNA (extension)

Denaturacja

Rozdzielenie nici DNA pod wpływem
temperatury. Temperatura denaturacji zależy
od składu zasad fragmentu który chcemy
powielić.

Najpopularniejsza polimeraza używana standardowo
w PCR to Taq – wytrzymuje temperaturę 94-95 stopni
C.

Przy fragmentach bogatych w GC używa się
polimeraz bardziej termostabilnych (np. Pwo, Pfu).

Annealing

Polega na tworzeniu odcinków dwuniciowych, składających
się z przygotowanych starterów - cząsteczek DNA
komplementarnych do sekwencji DNA oskrzydlających gen
mający ulec namnożeniu - z matrycową cząsteczką DNA.

Stosuje się temperaturę około 3-5 stopni poniżej oszacowanej temperatury topnienia.
Uproszczony wzór na temperaturę topnienia dla starterów o długości około 20
nukleotydów:

T=2x(A+T) + 4(G+C)

Temperatura:

-

za wysoka - słaba wydajność

-

zbyt niska - niespecyficzne powielanie

Extension

Właściwa synteza DNA i tym samym
amplifikacja pożądanego genu.

Temperatura tej części cyklu zależy od właściwości
polimerazy.

Dla polimerazy Taq optymalna jest temperatura 72-78
stopni. Szybkość reakcji w optymalnych warunkach dla
polimerazy Taq wynosi około 2000 nt/min. Do pełnej syntezy
badanego fragmentu czas trwania tego etapu wyznaczamy
zakładając połowę optymalnej prędkości.

Wykorzystanie

techniki PCR w

medycynie

• Diagnozowanie chorób powodowanych np. przez

HBV, HCV, HIV, CMV, EBV

• Identyfikacja infekcji grzybiczych
• Diagnostyka chorób nowotworowych
• Diagnostyka chorób genetycznych
• Identyfikacja osób i próbek krwi oraz badanie

śladów biologicznych

RT-PCR

(reverse transcriptase PCR)

RNA nie może być podstawą dla reakcji PCR i wymagane jest użycie odwrotnej
transkryptazy w celu przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji, w
wyniku której powstaje cDNA. cDNA może być bezproblemowo amplifikowane.
RNA zostaje niejako z powrotem przepisane w gen, z którego uległo
transkrypcji. Za pomocą RT-PCR możemy powielać transkrypty dowolnych
genów.
RT-PCR dzieli się na dwa zasadnicze etapy: reakcja odwrotnej transkrypcji z
udziałem odwrotnej transkryptazy oraz amplifikacja – czyli wykładnicze
zwielokrotnienie ilości cDNA.

PCR w czasie rzeczywistym

(real time PCR)

Real-time PCR wykorzystując techniki fluorescencyjne, pozwala na
monitorowanie ilości produktu reakcji w każdym cyklu prowadzonej reakcji
PCR.
Umożliwia wgląd w kinetykę reakcji, a co za tym idzie pozwala na oszacowanie
ilości produktu na początku reakcji, co jest niemożliwe w konwencjonalnej
metodzie PCR.
Ponadto dzięki temu, że amplifikacja kwasów nukleinowych i detekcja
produktu odbywa się w jednym zamkniętym naczyniu, ryzyko
zanieczyszczenia badanej próby jest minimalne

Multiplex PCR

Technika służąca do amplifikowania wielu matryc podczas
jednej reakcji PCR. Dzięki jednoczesnemu wykorzystaniu
różnych zestawów primerów metoda ta zapewnia dużą
oszczędność czasu oraz pozwala obniżyć koszty
przeprowadzanych badań przy jednoczesnym zachowaniu
wysokiej jakości uzyskiwanych wyników

RFLP PCR

Pozwala odkryć niektóre mutacje w interesującej nas sekwencji DNA.
Po namnożeniu odpowiedniego fragmentu (np. genu, którego mutacja
wywołuje jakąś chorobę), trawi się go za pomocą tak zwanych
enzymów restrykcyjnych. Są to białka, które rozpoznają, a następnie
przecinają określoną krótką sekwencję. Jeśli w obrębie takiej
sekwencji nastąpi zmiana (mutacja) - miejsce cięcia zniknie i
uwidoczni się to we wzorze prążków, powstałych po rozdziale
produktów reakcji PCR – RFLP w żelu. Może się również zdarzyć, że w
skutek mutacji powstaną nowe miejsca restrykcyjne, co również
uwidoczni się za pomocą tej metody

Nested PCR

Polega ona na wykonaniu dwuetapowej amplifikacji. Produkty
powstające w pierwszym etapie mogą wciąż zawierać
niespecyficznie namnożone fragmenty DNA. Niepożądane tło
zostaje zredukowane dzięki przeprowadzeniu kolejnej reakcji.
Jej produkt może być wykorzystywany jako sonda molekularna
w hybrydyzacji lub kontrola specyficzności namnażania
matrycy

Dziękuję za uwagę