Budowa

cytometru

przepływowego

Cytometr przepływowy

Cytometr przepływowy jest specjalistycznym

urządzeniem, na którym wykonywane są pomiary
metodą cytometrii przepływowej. Służy on do
szybkiego pomiaru dużej ilości cząstek lub
komórek zawieszonych w cieczy i przepływających
jedna za drugą przez punkt pomiarowy.

Cytometr przepływowy wraz z oprogramowaniem

komputerowym zapewnia wieloparametrową
ocenę ilościową oraz jakościową pojedynczych
komórek w sposób szybki, precyzyjny i
powtarzalny.

Cytometr

przepływo

wy

Układ

ciśnieniowo-

cieczowy

(hydrauliczny)

Układ

optyczny

Układ

elektroniczny

Układ ciśnieniowo-cieczowy

Inaczej nazywany układ hydraulicznym. Dostarcza on

zawiesiny badanych komórek do komory pomiarowej.
W czasie przechodzenia przez komorę zawiesina
komórek otoczona jest izotonicznym płynem
osłonowym i przepływa równomiernie, co zapobiega
zlepianiu się komórek. Konstrukcja cytometru
zapewnia laminarny przepływ komórek i ich
dostatecznie niskie stężenie tak, aby przepływały
pojedynczo dokładnie w środku kanału.

Najważniejszym elementem układu ciśnieniowo-

cieczowego jest pompa powietrzna. Wytwarza ona i
podtrzymuje podciśnienie stanowiące siłę napędową
buforu roboczego i zawiesiny komórek

Inne części to:
• Regulatory ciśnienia powietrza
• Regulator ciśnienia cieczy
• Filtr buforów
• Filtr powietrza
• Zbiorniki na bufor roboczy
• Zbiorniki na odpadki
• Komora przepływowa

Istotnym elementem układu jest
system transportu cieczy ze
specjalnym buforem. Posiada on
właściwości fizyczne pozwalające na
uformowanie cienkiego strumienia
zawiesiny komórek o średnicy 10-
100μm na zasadzie ogniskowania
hydrodynamicznego.

zawiesina
komórek

fluorescencja

promień lasera

ciecz osłaniająca

PRZEPŁYW KOMÓREK

Układ optyczny

Układ optyczny

Źródło światła

Źródło światła

Układ

kształtujący i

ogniskujący

wiązkę

laserową na

komórce

Układ

kształtujący i

ogniskujący

wiązkę

laserową na

komórce

Optyka

zbierająca

wygenerowane

sygnały

Optyka

zbierająca

wygenerowane

sygnały

Źródło światła

Źródłem światła są lasery emitujące

światło spójne, monochromatyczne o
dużym natężeniu i małej średnicy
promienia, przeważnie spolaryzowane
pionowo, o różnych długościach fal- od
UV poprzez światło niebieskie,
zielono-żółte do czerwonego.

Najpowszechniej stosowane są lasery gazowe:
• argonowy (najpowszechniejszy, emitujący

światło o długości fali 488 nm)

• kryptonowy
• kryptonowo-argonowy
• helowo-neonowy
• helowo-kadmowy

Coraz częściej jednak firmy produkują lasery

zbudowane na bazie kryształów ciał stałych.

Układ kształtujący i ogniskujący

wiązkę laserową na komórce

Każdy laser emituje światło o

charakterystycznej długości fali, a
specjalne filtry przepuszczają tylko
określone pożądane długości fali, co
jest konieczne ze względu na
szerokie widmo emisyjne
fluorochromów.

Stosuje się filtry:
• absorpcyjne (odcinające), które

przepuszczają światło o właściwej
długości fali

• interferencyjne, które wzmacniają lub

osłabiają daną długość fali

Szerokie widmo światła spowodowałoby, że

w cytometrach wielokolorowych
nieoddzielone sygnały poszczególnych
barwników fluorescencyjnych
nachodziłyby na siebie.

Optyka zbierająca sygnały

Optyka zbierająca sygnały rejestruje

światło załamane na komórce oraz
wyemitowane przez fluorochrom
promieniowanie fluorescencyjne.
Do tego celu stosowane są układy
luster, pryzmaty, soczewki
zbierające światło ugięte,
rozproszone i fluorescencję,
detektory.

Cytometr wyposażony
jest przeważnie w kilka
niezależnie
pracujących
detektorów
odczytujących
intensywność światła
rozproszonego i
fluorescencji o różnych
długościach fal. Czas
odczytu jest bardzo
krótki (ułamki
milisekundy), jego
efektem jest wysłanie
przez detektor impulsu
elektrycznego o
wielkości
proporcjonalnej do
natężenia odebranego
sygnału świetlnego.

PRZEDNI DETEKTOR
ŚWIATŁA ROZPROSZONEGO
(Forward Scatter)

Działa na zasadzie fotodiody i rejestruje

ugięte na komórkach światło lasera,
sygnał z niego otrzymywany jest
nazywany rozproszeniem pod małym
kątem (FSC). Fotodioda rejestruje
rozproszenie do przodu w niewielki kąt,
zwykle poniżej 10 stopni. Ugięcie światła
mierzone w osi wiązki lasera jest
proporcjonalne do wielkości komórki i nie
zależy od współczynnika załamania
światła cząsteczki oraz od jej kształtu.
Intensywność tego światła jest
proporcjonalna do: rozmiaru, kształtu i
granularności cytoplazmy.

detektor
przedni

laser

PRZEDNI DETEKTOR
ŚWIATŁA
ROZPROSZONEGO

BOCZNY DETEKTOR ŚWIATŁA
ROZPROSZONEGO (Side Scatter)

Działa na zasadzie fotopowielacza i rejestruje

rozproszone na ziarnistościach
wewnątrzkomórkowych światło lasera, sygnał z
niego otrzymywany jest nazywany rozproszeniem
pod dużym kątem (SSC). Fotopowielacz rejestruje
rozproszenie pod kątem 90 stopni. Rozproszenie
światła mierzone prostopadle do wiązki światła jest
sumaryczną miarą struktury komórki, w skład której
wchodzą ziarnistości w jądrze i cytoplazmie,
ukształtowanie powierzchni komórki i błon
śródplazmatycznych oraz inne struktury
rozpraszające światło i zależy od wielkości i kształtu
cząsteczki, jej współczynników załamania i odbicia
światła. Intensywność tego światła jest
proporcjonalna do: rozmiaru, kształtu i
granularności cytoplazmy

.

detektor boczny

laser

BOCZNY DETEKTOR
ŚWIATŁA ROZPROSZONEGO

DETEKTORY FLUORESCENCJI

• Fotopowielacze (ilość od 2 do 4)
• Można używać kilku barwników

fluorescencyjnych (izotiocyjanian
fluoresceiny, fikoerytryna, oranż akrydyny,
jodek propidyny) lub wyznakowanych
przeciwciał.

• Selektywność sygnału zapewniają

odpowiednio dobrane filtry optyczne i
lustra.

laser

Fr

e

q

Fluorescence

detektor
przedni

detektory fluorescencji
(PMT3, PMT4 etc.)

DETEKTORY
FLUORESCENCJI

•

SYSTEM OPTYCZNY

SYSTEM OPTYCZNY

lustro
dichroiczne

filtr zaporowy

laser

przepływ
komórek

PMT 5

PMT 1

PMT 2

PMT 4

PMT 3

detektor światła
rozproszonego

próbka

W układzie elektroniki jako detektorów

używa się fotopowielaczy. Wychodzący z
nich impuls dociera do wzmacniacza a
dalej do układu, który odczytuje
wartość szczytową każdego impulsu,
porównuje ją z nastawionym progiem
rejestracji i w przypadku, gdy sygnał
przekracza tę wartość, kieruje go do
przetwornika analogowo-cyfrowego. Po
przekształceniu sygnału na postać
cyfrową jest on wysyłany do komputera
celem dalszej analizy i przechowywania.

System komputerowy

Jest wraz z oprogramowaniem integralną i

niezbędną częścią każdego aparatu. Dzięki
wprowadzeniu standardu zapisu danych istnieją
programy, które można używać do odczytu
zbiorów danych z różnych aparatów.
Najważniejsze z nich to programy przeznaczone
do zbierania danych i programy służące do
analizy zebranego materiału. Te ostatnie
pozwalają na wszechstronną obróbkę danych z
możliwością ilościowej, jakościowej i
statystycznej oceny wybranych populacji
komórek.

Działanie cytometru

przepływowego

• Działanie cytometru przepływowego

polega na badaniu wąskiego strumienia
komórek, przepuszczanego przez strefę
pomiarów, gdzie pada nań światło lasera.

• Bezpośrednio przed komorą przepływową

zawiesina komórek z próbki jest
wprowadzana w bieg buforu roboczego.
Przez całą długość komory oraz punkt
detekcji komórki płyną laminarnie z
odpowiednią szybkością, jedna za drugą.

• Ich strumień przecina wiązka światła

laserowego, która jest rozpraszana
w kierunku prostopadłym lub
równoległym. Jednocześnie
emitowane jest światło wzbudzone
przez barwniki fluorescencyjne.

• Detektory o bardzo wysokiej czułości

rejestrują światło załamane na
każdej pojedynczej komórce oraz
wysyłane przez wzbudzony
fluorochrom sprzężony z komórką
za pośrednictwem przeciwciała.

• Wyniki pomiarów

przesyłane są do
komputera,
poddawane analizie
i przedstawiane na
ekranie monitora w
formie graficznej.

• Po pomiarach

komórki i bufor
roboczy trafiają do
zbiornika na odpady.

Sortery mają
zdolność nie
tylko zbierania
danych o
przepływających
komórkach (ich
analizy), ale
również izolacji
(sortowania) w
wysokim stopniu
czystości (>99%)
komórek
spełniających
określone przez
operatora
kryteria.

Sorter komórkowy

 Sortownik komórkowy umożliwia fizyczne
podzielenie analizowanych komórek na trzy
grupy różniące się własnościami.

 Tuż za obszarem pomiaru strumień zawiesiny
komórkowej poddawany jest działaniu
ultradźwięków, które dzielą go na mikroskopijne
kropelki - tak by w pojedynczej kropli mogła się
zmieścić tylko jedna komórka.

 Następnie krople przepływają przez szybko
zmieniające się pole elektromagnetyczne,
które nadaje kropli ładunek dodatni, ujemny, bądź
żaden.

 Stałe pole elektromagnetyczne wpływa na
kierunek przepływu pojedynczych kropli w
zależności od ich ładunku.

 Posortowane kropelki zawierające pojedyncze
komórki zbierane są w trzech oddzielnych
pojemnikach.

Sorter komórkowy

Dziękujemy za
uwagę

Bibliografia

• „Hematologia” pod red. Anny

Dmoszyńskiej

• „Immunologia kliniczna” pod red.

Marka L. Kowalskiego