Mikromacierz DNA-

To płytka szklana lub plastikowa z naniesionymi w

regularnych pozycjach mikroskopowej wielkości

polami (ang. spots), zawierającymi różniące się od

siebie sekwencją fragmenty DNA. Fragmenty te są

sondami, które wykrywają przez hybrydyzację

komplementarne do siebie cząsteczki DNA lub RNA.

Zastosowanie mikromacierzy DNA:

 Analiza jednonukleotydowych polimorfizmów DNA,

 Określenie zmian w poziomie ekspresji genów,

 Wykrywanie nowych transkryptów, 

 Określanie rejonów oddziaływań białko-DNA,

 W medycynie,

 W farmaceutyce,

 W diagnostyce chorób zakaźnych.

Mikromacierze cDNA

Macierze 

oligonukleotydowe, zwane 

„chipami DNA”

Technologie 

mikromacierzy DNA:

Mikromacierze cDNA

W mikromacierzach cDNA rolę sond odgrywają 
fragmenty cDNA , zwykle o długości 0,5-2,0 kbp, 
będące najczęściej produktami amplifikacji PCR, 
uzyskanymi z bibliotek cDNA lub zbioru klonów, w 
reakcji ze starterami specyficznymi dla wektora 
lub genu. W mikromacierzach cDNA jeden gen na 
płytce jest reprezentowany przez jeden rodzaj 
sond naniesionych w formie kropelki – „spotu”, w 
ściśle określonym miejscu , zdefiniowanym 
współrzędnymi. Typowa wielkość średnicy spotów 
wynosi 100-150 μm.

Zalety stosowania 

mikromacierzy cDNA

niekonieczna znajomość sekwencji całego 
genomu,

niski koszt eksperymentu,

możliwa równoległa analiza dwóch próbek 
(badanej i kontrolnej) na jednej macierzy,

prosta procedura znakowania i odmywania,

duża elastyczność, 

możliwość własnoręcznego zaprojektowania i 
przygotowania mikromacierzy,

Wady stosowania 

mikromacierzy cDNA:

prawdopodobieństwo wystąpienia hybrydyzacji 
krzyżowej,

niezbędna matryca biologiczna do syntezy sond,

czasochłonne przygotowanie sond,

więcej możliwości wprowadzenia błędów (PCR),

problemy z powtarzalnością,

dwuniciowe sondy (konieczność denaturacji, 
kompetycja wiązania).

Mikromacierze cDNA 

dzielimy na:



Mikromacierze cDNA drukowane na 

mikropłytkach szklanych



Mikromacierze cDNA drukowane na 

filtrach nylonowych

W mikromacierzach 
oligonukleotydowych sondy 
stanowią krótkie oligonukleotydy, 
zazwyczaj o długości 10-25 bp, 
otrzymane na drodze syntezy 
fotolitograficznej in situ na 
powierzchni płytki. W chipach DNA 
jeden gen jest reprezentowany 
przez kilkanaście par różnych 
oligonukleotydów. W tym przypadku 
wielkość średnicy „spotów” mieści 
się w granicach 2-20μm. W 
zależności od ilości spotów 
występujących na powierzchni, 
wyróżnia się mikromacierze 
oligonukleotydowe wysokiej (>10 
tys.), średniej (1-10tys.) i niskiej 
gęstości.

Macierze 

oligonukleotydowe

Zalety stosowania 

mikromacierzy 

oligonukleotydowych

:

wysoka specyficzność,

prosta synteza (chemiczna) sond i ich 
oczyszczanie,

duża powtarzalność,

jednoniciowe sondy (zbędna denaturacja, 
ograniczenie tworzenia struktur drugorzędowych),

dostępność wielu komercyjnych mikromacierzy, 
zwłaszcza dla znanych genomów (organizmów 
modelowych).

Wady stosowania 

mikromacierzy 

oligonukleotydowych

:

wysoki koszt,

trudności w znalezieniu unikatowych sekwencji w 
genomie,

duży wpływ składu nukleotydowego sond na proces 
hybrydyzacji,

konieczna znajomość sekwencji docelowych,

skomplikowany proces projektowania sond

Eksperyment 

mikromacierzowy:

Przygotowanie materiału do 

hybrydyzacji:

 syntetyzowanie 
cDNA w reakcji 
odwrotnej 
transkrypcji

 powstanie cRNA w 
wyniku reakcji 
transkrypcji in vitro
 

 wprowadzenie 
zmodyfikowanych 
nukleotydów z 
dołączonymi 
znacznikami 
fluorescencyjnymi

 fragmentacja i 
hybrydyzacja z płytką 
mikromacierzową

Znakowanie mikromacierzy:

Metoda bezpośrednia polegająca na 
wprowadzeniu nukleotydów dUTP lub DTP 
i:

• jednego znacznika fluoroscencyjnego 

• dwóch różnych znaczników 

fluorescencyjnych

 Metoda bezpośrednia polegająca na 

fragmentacji badanego materiału i 
znakowaniu jego końców (Metoda ta 
wykazuje największą efektywność 
znakowania dla jednoniciowego DNA, 
można ją jednak wykorzystać również 
do znakowania dwuniciowego DNA oraz 
RNA.)

Opis eksperymentu 

mikromacierzowego:

Badany RNA poddaje się przepisaniu 
na cDNA (odwrotna transkrypcja), 
następnie fluorescencyjnie znakuje, 
hybrydyzuje z DNA 
immobilizowanym na płytce po czym 
następuje skanowanie i zbieranie 
danych. W technice tej wykorzystuje 
się dwa barwniki fluorescencyjne, 
najczęściej są to Cy3 i Cy5. Każdym z 
barwników znakuje się DNA z innej 
puli, dzięki czemu na jednej płytce 
można porównywać ze sobą dwie 
tkanki i analizować różnice w 
ekspresji poszczególnych genów. 
Informacje o hybrydyzacji uzyskuje 
się za pomocą skanera optycznego 
zapisującego fluorescencję dla 
każdego punktu mikromacierzy.

Na każdym z etapów sprawdza się jakość mikromacierzy wykluczając 
takie, które mają poważne defekty techniczne. Następny etap zwany jest 
filtrowaniem genów i ma na celu wybranie tzw. genów różnicujących, 
których ekspresja zmienia się istotnie w badanych warunkach, oraz 
odrzucenie tych, które nie dają żadnego sygnału. Na podstawie tak 
zredukowanego zestawu genów prowadzi się analizy wyższego rzędu, 
poszukując grup genów o podobnym/odmiennym profilu ekspresji. Na 
zakończenie uzyskane wyniki poddawane są interpretacji biologicznej, 
polegającej na powiązaniu obserwowanych zmian w poziomie ekspresji 
genów z fizjologicznymi bądź patologicznymi procesami zachodzącymi w 
badanym organizmie.

W kolejnym etapie 
każdemu punktowi 
przyporządkowana zostaje 
liczba określająca 
natężenie fluorescencji. 
Uzyskane w ten sposób 
„surowe” dane liczbowe 
poddawane są najpierw 
normalizacji lokalnej (w 
obrębie pojedynczej 
płytki), a następnie 
globalnej
(w obrębie wszystkich 
mikromacierzy 
składających się na 
eksperyment). 

KONIEC 

Przygotowała:
Monika Wrońska.