SPEKTROSKOPIA

FLUORESCENCYJNA

Urszula Radziwanowska

Spektroskopia fluorescencyjna

Jest to metoda analizy składu
chemicznego. Próbka jest oświetlana
promieniowaniem UV lub VIS, które
wzbudza emisję promieniowania
charakterystycznego dla danego
materiału. Pierwiastki zawarte w
próbce są identyfikowane poprzez
charakterystyczne linie widmowe, a
ich koncentracja może być
wyznaczona przez natężenia tych linii.

Fluorescencja

Zjawisko uznaje się
za fluorescencję,
gdy po zaniku
czynnika
pobudzającego
następuje szybki
zanik emisji w
czasie około 10

−8

Jeden z rodzajów luminescencji –
zjawiska emitowania światła przez
wzbudzony atom lub cząsteczkę.

Mechanizm fluorescencji

Padający foton wzbudza elektron w cząsteczce lub
atomie. Wzbudzenie to wiąże się z przejściem elektronu
do wzbudzonego stanu singletowego. Przy przejściu
elektronu ze wzbudzonego stanu singletowego do stanu
podstawowego następuje emisja światła. Długość fali
promieniowania (wyemitowanego światła) jest dłuższa
od długości fali zaabsorbowanej. Wynika to z degradacji
części energii podczas przejść termicznych i
bezpromienistych. Jest to tzw. przesunięcie Stokesa.

Mechanizm
fluorescencji

Diagram Jabłońskiego

S stany singletowe; T stany trypletowe; A absorpcja; F fluorescencja;

P fosforescencja; IC konwersja wewnętrzna; ISC konwersja

interkombinacyjna

Widmo emisyjne

Widmo spektroskopowe, które jest obrazem promieniowania
elektromagnetycznego, wysyłanego przez ciało.
Widmo emisyjne powstaje, gdy obdarzone ładunkiem elektrycznym
elektrony, atomy, cząstki lub fragmenty cząsteczek tworzących
dane ciało, będąc wzbudzonymi przechodzą ze stanu o wyższej do
stanu o niższej energii. Przejściu temu towarzyszy emisja kwantu
promieniowania elektromagnetycznego o energii równej różnicy
energii poziomów, między którymi przeszła cząstka.

Reguła Stokesa

Długości fali promieniowania fluorescencyjnego są
większe od długości fali promieniowania wzbudzającego
fluorescencję lub co najwyżej im równe.

Reguła Wawiłowa

Wydajność kwantowa fluorescencji (f) nie zależy od
długości fali światła wzbudzającego

Zależy od względnej szybkości (czasów życia)
wszystkich procesów dezaktywacyjnych (k = 1/t)

Fluorofor

To część cząsteczki, odpowiedzialna za jej

fluorescencję. Najczęściej jest to grupa funkcyjna,

zdolna do absorbancji energii o określonej długości

fali, a później do wyemitowania innej długości fali

(ściśle określonej). Ilość energii, jak i długość fali

emitowanej zależy od właściwości fluorofora, ale też

od środowiska chemicznego w jakim on działa (na

przykład pH czy siły jonowej). Zależności te są

podstawą w zastosowaniu fluoroforów w biochemii, na

przykład immunofluoroscencji.

Fluorofory mogą mieć możliwość do syntezowania

ich do wybranej, innej cząsteczki, na przykład białka

w celu jego późniejszej wizualizacji. Istnieją też białka

naturalnie wyposażone we Fluorofory, na przykład

zielone białko fluoryzujące czy czerwone białko

fluoryzujące.

Spektrofluorymetr

Zastosowanie spektroskopii
fluorescencyjnej



Medycyna i analiza kliniczna –oznaczanie witamin, enzymów,
hormonów, środków dopingujących.



Farmacja –badania metabolizmu (barbiturany, amfetamina, LSD)



Biochemia – detekcja i oznaczanie śladów enzymów, koenzymów,
lipidów, kwasów nukleinowych, protein, chlorofilu



Żywność – detekcja śladowych komponentów w produktach
spożywczych (aminokwasy, witaminy, proteiny, toksyny)



Środowisko –powietrze, woda i gleby (policykliczne węglowodory
aromatyczne PAH, aflatoksyny, PCB, fenole, pestycydy)



Analiza organiczna i nieorganiczna – oznaczanie wszelkich substancji
fluoryzujących .Inne – detekcja w HPLC, sensory fluorescencyjne,
badania fotochemiczne i fotofizyczne stanów wzbudzonych,
spektroskopia czasów życia - techniki impulsowe, mikroskopia.