OZNACZANIE ST
ŻENIA BARWNIKÓW W WODZIE
METOD
UV-VIS
I. SPEKTROFOTOMETRIA UV-Vis
Spektrofotometria w zakresie nadfioletu (ang. ultra-violet çÅ‚ UV) i promieniowania
widzialnego (ang. visible- Vis), czyli spektrofotometria UV-Vis, jest technikÄ… instrumentalnÄ…,
w której do celów analitycznych wykorzystuje się przejścia energetyczne zachodzące
w czÄ…steczkach, spowodowane absorpcjÄ… promieniowania elektromagnetycznego w zakresie
nadfioletu (200-380 nm), widzialnym (380-780 nm) lub bliskiej podczerwieni. Technika ta
polega na ilościowym pomiarze absorpcji, emisji lub odbicia światła.
WzrastajÄ…ca energia

Wzrastająca długość fali, 
Nad-
Promienie
Promienie X Podczerwień Fale radiowe
fiolet
Gamma
Promieniowanie widzialne
Rys. 1. Widmo elektromagnetyczne.
Metodą spektrofotometrii UV-Vis można oznaczać substancje organiczne (np. wiele związków
posiadających wiązanie Ą lub elektrony n, w tym węglowodory aromatyczne, aldehydy, ketony,
kwasy i aminy) i nieorganiczne (np. pierwiastki ziem rzadkich, ozon, SO2) wykazujÄ…ce absorpcjÄ™
w nadfiolecie, zwiÄ…zki absorbujÄ…ce promieniowanie w zakresie widzialnym, w tym barwne
związki organiczne (barwniki) i barwne sole metali (np. KMnO4, CuSC4) oraz substancje, których
formy absorbujące promieniowanie uzyskuje się na drodze reakcji chemicznych. Do celów tych
najczęściej wykorzystuje się reakcje kompleksowania.
Głównymi zaletami tej metody są:
1. Duża czuÅ‚ość, której miarÄ… jest molowy współczynnik absorpcji µ, odpowiadajÄ…cy max
badanego roztworu. WartoÅ›ci µ dla czuÅ‚ych metod wynoszÄ… powyżej 10000 dm3·mol-1·cm-1.
Metody maÅ‚o czuÅ‚e charakteryzujÄ… siÄ™ współczynnikami µ o wartoÅ›ciach poniżej
1000 dm3 · mol-1·cm-1.
2. Duża precyzja oznaczeń. Precyzja oznaczeń zależy od zakresu oznaczanych stężeń i od klasy
stosowanych aparatów. W metodach spektrofotometrycznych można uzyskać wyniki, których
błąd nie przekracza ą0,2 %.
3. Selektywność oznaczeń uwarunkowana z jednej strony selektywnością absorpcji, z drugiej zaś
selektywnością odczynników wywołującą barwną reakcję z substancją oznaczoną.
II. ABSORPCJA
WiÄ…zka promieniowania monochromatycznego przechodzÄ…ca przez warstwÄ™ roztworu jest
osłabiona w stosunku do padającego. Promieniowanie o natężeniu I0 ulega częściowo odbiciu lub
rozproszeniu, częściowo pochłonięciu, a tylko częściowo przechodzi przez roztwór (Rys. 2.).
I0 = Ir + I + It
p
Rys. 2. Schemat ilustrujący zjawisko absorpcji promieniowania. Io- natężenie wiązki promienio-
wania monochromatycznego, Ir natężenie promieniowania rozproszonego i obitego, Ip natężenie
promieniowania pochłoniętego, It natężenie promieniowania przechodzącego przez roztwór.
Prawa absorpcji
I prawo absorpcji (prawo Lamberta)
Wiązka promieniowania monochromatycznego po przejściu przez jednorodny ośrodek
absorbujący o grubości b ulega osłabieniu zgodnie z równaniem:
I = I0 Å" e-kb
gdzie:
I0 - natężenie wiązki promieniowania monochromatycznego padającego na jednorodny ośrodek
absorbujÄ…cy,
I - natężenie promieniowania po przejściu przez ośrodek absorbujący,
k - współczynnik absorpcji,
e - podstawę logarytmów naturalnych. Stąd:
I0 I0
ln = kb = A lub A = log = ab
I I
gdzie:
a = 0,4343 k,
A - zdolność pochłaniania promieniowania zwana absorbancją.
I prawo absorpcji można zatem sformułować w sposób następujący:
Absorbancja jest proporcjonalna do grubości warstwy absorbującej, jeśli wiązka promieniowania
monochromatycznego przechodzi przez jednorodny ośrodek absorbujący.
Inną wielkością stosowaną do określania absorpcji promieniowania jest transmitancja
(przepuszczalność) T określana jako:
I
T =
I0
zatem:
1
A = log
T
Transmitancję podajemy najczęściej w procentach, stąd:
I 100
%T = 100 = 100T lub A = log
I0 %T
II prawo absorpcji (prawo Lamberta-Beera)
Prawo to dotyczy absorpcji promieniowania przez roztwory. Jeśli współczynnik absorpcji
rozpuszczalnika jest równy zeru, to wiązka promieniowania monochromatycznego po
przejściu przez jednorodny roztwór substancji absorbującej o stężeniu c ulega osłabieniu
zgodnie z równaniem:
I = I0 Å" e-kbc
Stąd, po przekształceniach jak wyżej, można zapisać:
I0
A = log = abc
I
II prawo absorpcji można sformułować w sposób następujący:
Jeżeli współczynnik absorpcji rozpuszczalnika jest równy zeru, to absorbancja wiązki
promieniowania monochromatycznego przechodzącej przez jednorodny roztwór jest wprost
proporcjonalna do stężenia roztworu c i do grubości warstwy absorbującej b.
III prawo absorpcji (prawo addytywności absorpcji)
Absorbancja roztworu wieloskładnikowego równa się sumie absorbancji poszczególnych
składników:
A = A1 + A2 + ... + An
gdzie
A1, A2, ..., An - absorbancje poszczególnych składników.
W równaniu:
A = abc
wielkość a jest wÅ‚aÅ›ciwym współczynnikiem absorpcji, gdy stężenie wyrażamy w [kg · dm-3] lub
[g · cm-3]. Gdy stężenie c wyrazimy w [mol · dm-3], równanie to przybiera postać:
A = µbc
gdzie µ jest to molowy współczynnik absorpcji, a jego wymiar podawany jest dwojako:
[dm3 · mol-1 · cm-1] lub w jednostkach SI [m2 · mol-1].
Addytywność absorbancji jest spełniona, jeśli pomiędzy składnikami środowiska absorbującego
nie ma żadnych oddziaływań chemicznych. Oznacza ona, że każde indywiduum absorbuje tak,
jakby inne były nieobecne.
Jeżeli roztwór spełnia II prawo absorpcji, wykres funkcji A = f (c) jest linią prostą, (Rys. 3).
Współczynnik µ ma wartość staÅ‚Ä… dla danego chromoforu, nie zależnÄ… od stężenia roztworu c.
Wykres funkcji µ = f (c) jest liniÄ… prostÄ… równolegÅ‚Ä… do osi odciÄ™tych (Rys. 4).
A
µ
A=f(c)
µ=f(c)
c c
Rys. 3. Wykres zależności A=f(c).
Rys. 4. Wykres zależnoÅ›ci µ=f(c).
Ograniczenia w stosowaniu prawa Lamberta-Beera
W myśl II prawa absorpcji zależność absorbancji od stężenia powinna mieć charakter
liniowy. W praktyce spotykamy się z odchyleniami od przebiegu prostoliniowego, zarówno z
ujemnymi, jak i z dodatnimi (Rys. 5.) .
Rys. 5. Typowe odstępstwa od prawa Beera: I - prosta dla układu spełniającego prawa absorpcji,
II - krzywe dla układów nie spełniających praw absorpcji. Główne przypadki odstępstw
charakteryzujÄ… siÄ™ zmianÄ… współczynnika absorpcji (µ): a) zmniejszanie siÄ™ ze wzrostem stężenia;
(b) wartości różne od rzeczywistej niezależnie od stężenia; (c) wzrost ze wzrostem stężenia.
Powyższe odchylenia mogą być wywołane przez:
podstawowe ograniczenia praw
współczynnik absorpcji zależy od współczynnika załamania promieniowania w danym
Å›rodowisku; dla roztworów rozcieÅ„czonych (c<10-2 mol·dm-3) współczynnik zaÅ‚amania jest
stały i identyczny ze współczynnikiem załamania czystego rozpuszczalnika. W roztworach
o większych stężeniach, zmiany wartości współczynnika załamania mogą być przyczyną
odstępstw od praw absorpcji,
występowanie innego niż absorpcja oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego.
czynniki chemiczne powodujÄ…ce odchylenia od prostoliniowego przebiegu absorbancji
zwiÄ…zane sÄ… z reakcjami chemicznymi zachodzÄ…cymi w analizowanym roztworze. Ponadto
prawo Lamberta może być spełnione tylko dla przypadku istnienia w roztworze jednej formy
cząsteczek. W wyniku zmiany pH czy stężenia roztworu część z nich może ulec zmianom lub
deformacjom (dysocjacja, asocjacja, polimeryzacja, solwatacja, a także różne reakcje
kompleksowania) co prowadzi do zmiany wartości molowych współczynników adsorpcji
odpowiednich cząstek i zaburzenie prostoliniowego charakteru zależności A=f(c).
czynniki aparaturowe.
brak ścisłej monochromatyzacji wiązki promienia,
 jeżeli w przyrządzie zachodzi rozpraszanie promieniowania; wywiera ono tym większy
wpływ, im większe są wartości mierzonych absorpcji,
zbyt duża szerokośćspektralna wiązki promieniowania przechodzącego przez próbkę.
III. APARATURA
Podstawowymi częściami składowymi spektrofotometrów UV-vis są:
1. y
ródło promieniowania,
2. układ optyczny (monochromator),
3. pomieszczenie na komórkę pomiarową,
4. detektor mierzący natężenie promieniowania,
5. wskaz
nik, rejestrator, komputer.
z
ródło kuweta
monochromator detektor
promieniowa pomiarowa
wskaz
nik
i rejestrator
Rys. 6. Schemat blokowy spektrofotometru UV-Vis
y
ródło promieniowania
Jako z
ródło promieniowania stosowane są:
a) lampy deuterowe çÅ‚ w zakresie od 180 nm do 380 nm,
b) lampy wolframowo-halogenowe çÅ‚ powyżej 380 nm przez zakres widzialny i bliskÄ…
podczerwień,
c) wysokociÅ›nieniowe Å‚ukowe lampy ksenonowe çÅ‚ sÄ… z
ródłem ciągłego promieniowania,
pokrywającego cały zakres UV-Vis.
Monochromator ma za zadanie wybrać, z emitowanego przez z
ródło promieniowania
ciągłego, wąskie pasmo o żądanej długości fali i przepuścić je przez komórkę z badaną
substancją. Elementy wchodzące w skład układu optycznego przedstawiono na Rysunku 9.
Komórka pomiarowa. Do pomiarów absorpcji gazów i cieczy stosowane są kuwety. Do
badań w nadfiolecie przy długościach fali 200- 380 nm stosuje się kuwety wykonane
z kwarcu lub ze stopionej krzemionki, ponieważ materiały te nie pochłaniają promieniowania
z tego zakresu. W zakresie widzialnym widma można stosować kuwety szklane.
W szczególnych przypadkach używa się kuwet wykonanych z tworzyw sztucznych.
Grubość warstwy
Standardowa grubość kuwet wynosi 10 mm, ale są
Kuweta
również dostępne kuwety o grubości mniejszej (np.
pomiarowa
1 mm) oraz większej (np. 100 mm). Kuweta pomiarowa
powinna zapewniać dokładnie zdefiniowaną grubość
Analit
warstwy absorbującej cieczy, wykazywać odporność na
Io IT
działanie analizowanych substancji chemicznych oraz
zapewniać w maksymalnym stopniu transmitancję
promieniowania.
*Do uzyskania optymalnych wyników analizy ważny jest odpowiedni dobór
rozpuszczalnika. Rozpuszczalnik musi wykazywać niską absorpcję w tych zakresach
widma, w których absorbuje badana próbka., nie może reagować z substancją
rozpuszczoną, a także powinien wykazywać małą lotność.
Detektory fotoelektryczne stosowane w spektrofotometrach UV-Vis przetwarzajÄ… energiÄ™
promieniowania elektromagnetycznego na energię elektryczną. Najczęściej stosowane są
fotokomórki, fotopowielacze oraz fotodiody.
METODY OZNACZEC
SPEKTROFOTOMETRYCZNYCH.
Ilościowe oznaczenia metodą spektrofotometrii UV-Vis należą do metod porównawczych.
Oznaczenie pojedynczego składnika przeprowadza się:
1) Metodą porównywania z pojedynczym wzorcem. Mierzymy absorbancję Ax roztworu
badanego o stężeniu cx i absorbancję As roztworu wzorcowego o znanym stężeniu cs przy tej
samej długości fali  i w kuwetach o tej samej grubości b. Z porównania zmierzonych
absorbancji na podstawie prawa Lamberta Beera, można obliczyć stężenie badanej próbki ze
wzoru: Ax
cx = cs .
As
2) Metodą porównywania z kilkoma wzorcami, czyli metodą krzywej wzorcowej.
W metodzie tej wykorzystuje się serię roztworów wzorcowych o stężeniu analitu 0 (ślepa
próba), 1, 2, 3, 4, 5 i dla każdego roztworu mierzy się absorbancję. Następnie wykreśla się
krzywą kalibracyjną A=f(c). Dla badanej próbki mierzy się absorbancję i z krzywej
kalibracyjnej odczytuje stężenie cx
3) Metodą dodatku wzorca. Procedura oznaczeń w tej metodzie sprowadza się do pomiaru
absorbancji Ao próbki badanej o stężeniu cx i absorbancji Ai mieszaniny próbki badanej o
stężeniu cx z dodatkiem wzorca o znanym stężeniu cs. Metoda ta może być stosowana tylko w
przypadku, gdy w badanym zakresie występuje prostoliniowa zależność A od c.
Metodą spektrofotometrii UV-Vis możliwe są także oznaczenia ilościowe mieszanin złożonych
z dwu i z wielu absorbujących składników. Ze względu jednak na możliwość nakładania się na
siebie krzywych adsorpcji, oznaczenia te wymagajÄ… zastosowania bardziej skomplikowanych
procedur niż w przypadku oznaczeń pojedynczych składników.
Zastosowanie spektrofotometrii UV-Vis w analizie jakościowej.
Elektronowe widmo absorpcyjne jest cechą charakterystyczną związku chemicznego i określa
jednoznacznie związek jednorodny. W przypadku związków organicznych widma w zakresie 180-
800 nm są stosowane do ustalenia pewnych zależności strukturalnych i identyfikacji grup
funkcyjnych. Wynika to z obecności w cząsteczce chromoforów- ugrupowań odpowiedzialnych za
absorpcję promieniowania w tym zakresie. Najczęściej są to pierścienie aromatyczne (aromatyczny
sekstet elektronów), wiązania wielokrotne (ich część - wiązania typu Ą) zarówno między atomami
węgla jak i inne, np. grupy karbonylowej C=O.
Tabela 1. Struktury oraz właściwości absorpcyjne wybranych chromoforów
chromofor
benzenowy
chromofor
C C
alkenowy
chromofor
N N
azowy
chromofor
C O
karbonylowy
chromofor
N O
nitrozowy
chromofor
C S
tiolowy
Obok pojęcia chromoforu w spektroskopii UV-Vis używa się pojęcia auksochromu.
Auksochromami są różne grupy funkcyjne w cząsteczce, które choć same nie pochłaniają
energii z zakresu UV-Vis, swoją elektroujemnością wpływają na energię chromoforu,
przesuwając absorpcję w kierunku fal dłuższych. Do najpopularniejszych auksochromów
należy grupa aminowa i hydroksylowa. Grupy te nie są auksochromami z definicji. Pełnią
rolę auksochromów, gdy są tak powiązane z chromoforem, że mogą wpływać na jego energię,
np. grupa hydroksylowa w fenolu (bezpośrednie powiązanie z chromoforem i możliwość
oddziaływania chromofor-auksochrom) pełni role auksochromu, natomiast grupa
hydroksylowa w alkoholu benzylowym auksochromem nie jest (grupa CH2 między
hydroksylem i pierścieniem skutecznie blokuje wpływ wolnych par tlenu na pierścień).
Auksochrom z jednej strony wpływa na wartość energii podstawowego poziomu
energetycznego chromoforu, z drugiej strony może oddziaływać z otoczeniem cząsteczki
(wartość pH roztworu, polarność rozpuszczalnika itp.), które z kolei modyfikuje jego siłę
oddziaływania na chromofor. Tak więc poprzez auksochrom, otoczenie może modyfikować
energię chromoforu zmieniając tym samym położenie, a czasem i kształt widma.
Rys. 8. Przykładowe widmo tej samej substancji zarejestrowane w roztworach o trzech
różnych wartościach pH (pH=1, kwaśny; pH=7, obojętny i pH=10, zasadowy).
Taki wpływ otoczenia na kształt i położenie widma czasem utrudnia pomiary i każe pamiętać,
że widmo UV-Vis jest charakterystyczne dla danej substancji w danych (określonych)
warunkach, z drugiej strony jest przydatnym w badaniach struktury czÄ…steczki, pozwalajÄ…c
np. określić, czy grupa aminowa ma charakter aromatyczny (auksochrom, wyraz
ny wpływ pH
na położenie maksimum pasma) czy też alifatyczny (połączona z pierścieniem poprzez
łańcuch węglowy, widmo nie reaguje na zmiany pH).
CEL ĆWICZENIA
Celem niniejszego ćwiczenia jest zapoznanie się z zasadą działania i pracą Spektrofotometru
UV-Vis A2800 firmy Hitachi. i oznaczenie stężeń roztworów barwników metodą krzywej
wzorcowej. Analiza polega na pomiarze absorbancji analitu w całym zakresie UV-Vis
i wyznaczeniu max (długość fali, odpowiadająca najbardziej intensywnemu pasmu absorpcji).
Następnie należy przeprowadzić pomiary absorbcji badanych próbek przy wyznaczonej
długości fali i na podstawie sporządzonej krzywej kalibracji wyznaczyć ich stężenie oraz
wartoÅ›ci µ.
D2 Lampa UV
Siatka
dyfrakcyjna
Lustro 1
Szczelina 1
Szczelina 2
WI lampa Vis
Filtr
Kuweta
referencyjna
Detektor 2
Lustro 4
WiÄ…zka
referencyjna
Soczewka 1
Lustro 2
Lustro
półprzepuszczalne
Kuweta
próbki
Detektor 1
WiÄ…zka
pomiarowa
Lustro 3
Soczewka 2
Komora
Monochromator
pomiarowa
Rys. 8. Schemat budowy i działania spektrofotometru UV-Vis
Na rysunku 8. przedstawiono schemat budowy dwuwiÄ…zkowego spektrofotometru UV-Vis.
Szerokopasmowa wiÄ…zka promieniowania emitowanego przez lampÄ™ deuterowÄ… lub
jodowolframową kierowana jest przez zwierciadło skupiające (Lustro 1) na szczelinę
wejściową (Szczelina 1) i dalej na monochromator. Toroidalna siatka dyfrakcyjna powoduje
rozszczepienie wiązki promieniowania na poszczególne fale, tworząc uporządkowane według
długości fal continuum. Z tego continuum szczelina wyjściowa (Szczelina 2) wycina promień
światła monochromatycznego (zawierający tylko 1 długość fali), który następnie przechodzi przez
filtr i pada na zwierciadło toroidalne (Lustro 2). Promień odbity od tego zwierciadła dzieli się
następnie, przy pomocy pół-zwierciadła, na promień próbki i promień referencyjny
(porównawczy). Oba te promienie przechodzą następnie, odpowiednio, przez kuwetę próbki
badanej i kuwetę próbki odniesienia w komorze próbek. Po przejściu przez kuwety, oba
promienie ulegajÄ… skupieniu za pomocÄ… soczewek skupiajÄ…cych (Soczewka 1 i Soczewka 2).
Skupione promienie ulegajÄ… zogniskowaniu na fotodiodach krzemowych Detektor 1 i Detektor 2,
gdzie zostają przekształcone na sygnały elektryczne.
Rejestrując wartości absorbancji w funkcji zmieniającej się długości fali przechodzącej
przez roztwór otrzymujemy widmo. Zmiany długości fali najczęściej uzyskuje się zmieniając
w sposób ciągły i automatyczny kąt monochromatora w stosunku do padającej nań wiązki ze
z
ródła promieniowania.
Rys. 10. Przykład widma absorpcyjnego.
WYKONANIE DOÅšWIADCZENIA
Przygotowanie roztworów wzorcowych analitu
1) Przygotować roztwór podstawowy barwnika rozpuszczając 25 mg w 500 ml wody
destylowanej.
2) Do 8 probówek o pojemności 25 ml odmierzyć pipetą automatyczną: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8;
1,0; 1,2; 1,4; 1,6 ml roztworu podstawowego, uzupełnić wodą do 10 ml, zamknąć
probówki parafilmem i dokładnie wymieszać.
3) Obliczyć stężenia przygotowanych roztworów.
Przygotowanie badanej próbki
Dokłady opis kolejnych czynności przygotowania badanej próbki do analizy w
poszczególnych doświadczeniach będzie dostępny na zajęciach.
Wykonanie oznaczeń spektrofotometrycznych
1) Zarejestrować widmo roztworu podstawowego barwnika w całym zakresie UV-Vis
stosując wodę jako odnośnik w celu wyznaczenia analitycznej długości fali (max, nm), dla
maksimum pasma absorpcyjnego barwnika.
2) Przy wyznaczonej max zmierzyć absorbancję A roztworów wzorcowych analitu.
3) Przy wyznaczonej analitycznej długości fali zmierzyć absorbancję badanej próbki .
Opracowanie wyników i dyskusja:
1. Wyniki pomiarów zestawić w tabelach.
2. Przedstawić graficznie zależność A=f(c) otrzymaną na podstawie pomiarów absorbancji
roztworów wzorcowych (krzywa kalibracji).
3. Z parametrów otrzymanej prostej regresji oraz wyznaczonych eksperymentalnie wartości
absorbancji badanej próbki obliczyć stężenie barwnika w próbce.
4. Sformułować wnioski
Literatura
[1] Cygański, Metody spektroskopowe w chemii analitycznej, WN-T, Warszawa 1997.
[2] Szczepaniak W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej. W-wa, PWN, 2002.
[3] Ewing G. W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej. W-wa, PWN, 1980.
Przygotowała: Anna Kołodziej