Kształty i rozmiary komórek bakteryjnych

Komórki bakterii, tak różnorodne pod względem funkcji życiowych, żyjące w tak zróżnicowanych środowiskach, są zadziwiająco proste, jeśli chodzi o kształt (w porównaniu z organizmami eukariotycznymi). Zasadniczo, możemy tutaj wyróżnić kilka podstawowych form:

• ziarniak - mówimy o niej, gdy komórka bakteryjna ma kształt kulisty. Na uwagę zasługuje fakt, że mamy tutaj na myśli dojrzałe, wegetatywne formy bakterii. W niektórych stadiach życiowych, np. pod postacią spor, bakterie mogą przybierać inny kształt, niż formy wegetatywne. Z drugiej zaś strony, działając np. lizozymem, który rozkłada ściany komórkowe bakterii, można uzyskać komórki mające kulisty kształt w roztworze izotonicznym. Nazywamy je protoplastami, ale nie mają one nic wspólnego z kształtem komórki, z której powstały, dlatego nie są one ziarniakami

• laseczka (bacillus) i pałeczka (bacterium) - mówiąc o nich, mamy na myśli to, że kształt bakterii jest wydłużony. Rozróżnienie pałeczek od laseczek bywa nieco problematyczne. Jedni autorzy twierdzą, że pałeczki to formy wydłużone, grubsze od laseczek i w odróżnieniu od nich mogące wytwarzać zarodniki. Inni autorzy z kolei uważają, iż pałeczki to wydłużone, cylindryczne komórki gramujemne, natomiast laseczki to wydłużone, czasami nawet nitkowate formy gramdodatnie. Spotyka się także takie pozycje, w których mówi się jedynie o pałeczkach, mając na myśli wszystkie cylindryczne lub bardziej wydłużone kształty komórek bakteryjnych. Na potrzeby tego podręcznika pozostaniemy przy definicji laseczek, jako bakterii o kształcie cylindrycznym, mających zdolność do wytwarzania endospor.

• formy spiralne - jak sama nazwa wskazuje, mamy tutaj do czynienia z kształtami mniej lub bardziej skręconymi wokół osi.

Ten prosty podział można dalej rozszerzać na bardziej subtelne kształty. W przypadku ziarniaków możemy wyróżnić:

• pojedyncze komórki, tzw. ziarenkowce (coccus)

• dwoinki (diplococcus), czyli dwie połączone komórki

• paciorkowce (streptococcus), stanowiące łańcuch komórek i powstające na skutek podziałów kolejnych komórek w tej samej płaszczyźnie

• gronkowce (staphylococcus), będące, jak sama nazwa wskazuje, zgrupowaniami komórek o kształcie grona; powstają one na skutek podziałów komórek w wielu różnych płaszczyznach

• pakietkowce (sarcina), są one zgrupowaniami o kształcie sześcianów, powstającymi w wyniku podziałów w trzech różnych płaszczyznach

• tetrady to grupy czterech komórek połączonych ze sobą w jednej płaszczyźnie

Wśród form wydłużonych możemy, poza pałeczkami i laseczkami, wyróżnić:

• maczugowce (cornybacterium) o kształcie maczugi

• wrzecionowce o kształcie wrzeciona

• nici lub nitkowce, stanowiące bardzo silnie wydłużone komórki

Należy zauważyć, że niektóre gatunki bakterii, szczególnie te należące do form wydłużonych, mogą w zależności od warunków wykazywać dosyć duże zmiany w kształcie komórek. Zjawisko to nazywamy pleomorfizmem i jest ono spotykane zwłaszcza w przypadku maczugowców. Niezwykle ciekawym pod tym względem rodzajem bakterii jest Arthrobacter, którego można wyizolować z gleby. Młode kolonie tej bakterii wykazują obecność głównie form o kształcie silnie wydłużonych pałeczek, jednak kolonie starsze składają się praktycznie w całości z ziarenkowców. Przykład ten pokazuje, iż tak naprawdę, określanie kształtu bakterii jest w znacznej mierze umowne, a potwierdzić to może fakt, iż do dziś trwają dyskusje, które bakterie należy zaliczyć do maczugowców.

Zanim przejdziemy do formy spilralnych, pozwolę sobie jeszcze pociągnąć temat zmienności kształtu, ale tym razem w kontekście różnić między rodzajami. Otóż zasadniczo rzecz biorąc, można zwrócić uwagę na pewien szereg bakterii, przechodzących od form wydłużonych i nierozgałęzionych, poprzez formy słabo rozgałęzione (prątki), silnie rozgałęzione (Nocardia), aż po kształty komórek silnie rozgałęzionych (promieniowce - Streptomyces). Prątki mają kształt komórek nieregularny, lekko rozgałęziony. Nokardie z kolei, to gatunki komórek tworzących grzybnię, ale w starszych koloniach grzybnie te rozpadają się stopniowo na cylindryczne komórki. Jeśli zaś chodzi o Streptomyces, to tworzą one strukturę bardzo podobną do grzybni. W odróżnieniu od nokardii, promieniowce wytwarzają zarodniki, urzęsione lub nieurzęsione. Jako ciekawostki, dotyczące promieniowców, można podać dwa fakty. Po pierwsze, zapach świeżo zaoranej ziemi pochodzi właśnie od substancji wydzielanej przez te bakterie (1,10-dimetylodeka-9-olu, czyli geosminy). Po drugie, promieniowce wytwarzają szereg antybiotyków, np. streptomycynę, chloromycetynę czy też tetracyklinę, żeby wspomnieć chociażby najważniejsze gatunki Strepctomysces.

Wreszcie, jeśli chodzi o morfologię spiralną, wyróżnia się:

• krętki (spirochaetes) - mają komórkę skręconą o niezwykle charakterystycznej i niespotykanej wśród innych bakterii budowie

• przecinkowce (vibrio) - mają kształt przecinków, zbliżony do kształtu bumerangu

• śrubowce (spirillum) - mają śrubowaty kształt komórki i są urzęsione perytrychalnie

Morfologia bakterii ma znaczenie w identyfikacji gatunków i wspólnie z barwieniem metodą Gramma jest jednym z pierwszych kroków w określaniu przynależności systematycznej.

Wielkość bakterii

Bakterie, podobnie jak pozostałe komórki prokariotyczne, wykazują zwykle niewielkie rozmiary. "Standardowa" komórka bakteryjna, o ile w ogóle można coś takiego sobie wyobrazić, ma zwykle średnicę ok. 1 μm (tj. 10^-6m), przy długości nie przekraczającej 5 μm. Spotyka się jednak również bakterie o mniejszych wymiarach, np. wiele ziarniaków ma średnicę 0,5 μm, a z drugiej strony znane są również prawdziwe giganty. Największym znanym obecnie gatunkiem bakterii jest Thiomargarita namibiensis ("siarkowa perła Namibii"), której komórka może mieć długość nawet 2 mm. Mniejsze od bakterii są już tylko wirusy, natomiast nieco większe - komórki grzybów.

Budowa i znaczenie podstawowych struktur bakteryjnych

Komórki bakterii charakteryzują się pewnym wspólnym planem budowy, co ma zasadnicze znaczenie zwłaszcza w kontekście leczenia chorób zakaźnych. Różnice pomiędzy komórkami prokariotycznymi, a eukariotycznymi mogą więc prowadzić do opracowania strategii terapeutycznych, które przy minimalnym złym wpływie na organizm ssaka będą wywierać silny wpływ na bakterie. Nic więc dziwnego, że poznanie budowy poszczególnych struktur bakterii jest niezwykle istotne z medycznego punktu widzenia, z drugiej zaś strony jest także ciekawe, jeśli chodzi o czysto poznawczy punkt widzenia.

Każda komórka bakteryjna składa się z następujących elementów:

• ściany komórkowej, która otacza komórkę i pozwala na przeżycie bakterii w środowisku o innym ciśnieniu osmotycznym, niż wnętrze komórki bakteryjnej

• błony komórkowej, która ma charakter błony półprzepuszczalnej i bierze udział w transporcie substancji do wnętrza komórki, tudzież w wydzielaniu innych związków na zewnątrz

• cytoplazmy, wypełniającej komórkę, która jednak ma inną strukturę niż cytoplazma Eucaryota

• rybosomów, biorących oczywiście udział w produkcji białek, które także różnią się od rybosomów komórek eukariotycznych

• nukleoidu, czyli chromosomu bakteryjnego, niosącego materiał genetyczny

• różnych inkluzji cytoplazmatycznych, którymi są np. materiały zapasowe

Poza tymi "typowymi" elementami komórek bakterii, w zależności od gatunku, czy też przynależności systematycznej, możliwe jest występowanie następujących "dodatków":

• rzęsek, które umożliwiają ruch

• otoczek i śluzów, ochraniających komórkę od zewnątrz

• błony zewnętrznej, czyli dodatkowej błony, powlekającej ścianę komórkową u bakterii gramujemnych

• plazmidów, stanowiących koliste cząsteczki DNA, niosące dodatkową informację genetyczną

Wymienione powyżej struktury są szczegółowo omówione w dalszej części podręcznika.

Ściana komórkowa bakterii

Znaczenie ściany komórkowej

Ściana komórkowa jest strukturą, od której w znacznej mierze zależy kształt komórki. Ma ona formę woreczka, co odbija się w jej łacińskiej nazwie (łac. sacculus - woreczek). Można ją porównać do balonika, który przy odpowiednio dużym ciśnieniu staje się napięty. W tej analogii cytoplazma komórki odpowiada gazowi w baloniku. W odróżnieniu jednak od balonika, który jest całkowicie nieprzepuszczalny dla różnych substancji, przez ścianę komórkową mogą bez przeszkód przenikać substancje drobnocząsteczkowe - ich selekcja następuje dopiero dzięki obecności błony komórkowej. Generalnie można więc powiedzieć, że prawdziwe będzie stwierdzenie, iż ściana komórkowa pełni głównie funkcję mechaniczną, ograniczając objętość komórki bakteryjnej i chroniąc ją przed pęknięciem, gdy komórka znajdzie się w roztworze o niższym ciśnieniu osmotycznym, niż ciśnienie osmotyczne protoplastu.

Mimo że budowa ściany bakterii jest inna, niż w przypadku roślin, także u Procaryota można zaobserwować zjawisko plazmolizy, polegające na obkurczaniu się protoplastu podczas przebywania bakterii w środowisku hipertonicznym. Wypływ wody z komórki powoduje zmniejszenie objętości cytoplazmy i odstawanie błony komórkowej od ściany, przy czym komórka kurczy się tym bardziej, im większa jest różnica pomiędzy ciśnieniem osmotycznym cytoplazmy, a otaczającego komórkę środowiska. Jak widać, w tym miejscu analogia do balonika nieco zawodzi - ściana komórkowa jest wprawdzie strukturą elastyczną, ale tylko do pewnego stopnia, nie obkurcza się ona tak silnie, jak protoplast.

Struktura ściany komórkowej

Podobnie, jak można to zaobserwować w przypadku roślin, ściana komórkowa bakterii składa się z podstawowego szkieletu, w który "wplątane" są dodatkowe związki. Różnica w tym wypadku polega jednak na tym, że ów szkielet nie jest utworzony z celulozy, ale z mureiny, rodzaju peptydoglikanu. Mureina, w ogólnym zarysie, składa się z długich, nierozgałęzionych łańcuchów polisacharydowych, połączonych ze sobą za pomocą krótkich peptydów.

Łańcuchy polisacharydowe mają, w przypadku mureiny, zawsze taki sam skład chemiczny: można je rozpatrywać jako połączone liniowo cząsteczki N-acetyloglukozoaminy i kwasu N-acetylomuraminowego. Cechą charakterystyczną jest to, że cząsteczki tych cukrowców są ułożone na przemian, zatem cała struktura jest bardzo regularna. Dla zainteresowanych dodam, że wiązanie pomiędzy N-acetyloglukozoaminą a kwasem N-acetylomuraminowym to często występujące w przyrodzie wiązanie β-1,4-glikozydowe.

Nieco bardziej skomplikowana jest sprawa łańcuchów peptydowych, pozwalających na usieciowanie łańcuchów cukrowych. Mogą one mieć różny skład, ale dwie jego cechy są niezwykle istotne, o czym powiemy sobie nieco później. Pierwsza sprawa dotyczy tego, że w skład tych peptydów muszą wchodzić takie aminokwasy, które zawierają dwie reszty aminowe. Dlaczego? Otóż obecność dodatkowej reszty aminowej pozwala na utworzenie dodatkowego wiązania peptydowego. Znaczenie tego faktu jest takie, że krótkie peptydy, związane z resztami kwasu N-acetylomuraminowego, mogą łączyć się ze sobą, co w przypadku pojedynczej grupy aminowej byłoby niemożliwe. Posłużmy się jeszcze raz analogią. Łańcuchy polisacharydowe przyłączają peptydy, które można uznać za rączki, wyciągnięte w kierunku rączek innego łańcucha. W tym przypadku dodatkowe aminokwasy z dwiema resztami aminowymi pełnią funkcję dłoni, dzięki którym łańcuchy mogą się połączyć. Idąc w stronę nieco makabrycznego porównania, możemy powiedzieć, że po odcięciu dłoni niemożliwe będzie złapanie się łańcuchów za ręce. Wracając jednak do rzeczywistości, nadmienię jeszcze, że najczęściej spotykanymi aminokwasami z dwiema resztami aminowymi są: kwas mezo-diaminopimelinowy i L-lizyna.

Zwróć teraz uwagę, drogi Czytelniku, że aminokwasy, o których mówimy, mają wyraźnie zaznaczoną konfigurację przestrzenną - tutaj docieramy do drugiej sprawy związanej z charakterystyką ściany bakteryjnej. Każdy, kto spotkał się z biologią w stopniu wystarczającym do poznania bardzo ogólnej struktury białek, wie z pewnością, że dominują w nich aminokwasy w formie L. Tymczasem peptydy budujące ścianę bakterii zawierają także aminokwasy w formie D. Najczęściej spotykany jest kwas D-glutaminowy. Wydawać by się mogło, że jest to jedynie drobny szczegół, jednak nic bardziej mylnego. Chwila zastanowienia doprowadzi nas do wniosku, że ściana komórkowa, podobnie jak praktycznie wszystkie inne struktury komórkowe, powstaje przy udziale enzymów. W tym miejscu dochodzimy do sedna sprawy. Jeśli enzym, odpowiedzialny za wprowadzenie D-aminokwasu ma poprawnie zadziałać, musi oczywiście bezbłędnie go rozpoznać i odróżnić od formy L. Mówiąc inaczej, forma D powinna pasować do enzymu tak, jak prawa dłoń lub prawa stopa pasują do prawej rękawiczki lub prawego buta. Wprowadzając związek podobny do D-aminokwasu możemy "oszukać" enzym i zahamować syntezę ściany. Odkrycie takiego związku było jednym z największych biologicznych odkryć wszechczasów, ale o tym opowiemy w dalszej części niniejszego rozdziału. Teraz natomiast zagłębimy się jeszcze bardziej w budowę ścian komórkowych bakterii i zobaczymy, w jaki sposób od takiej stosunkowo prostej struktury zależą bardzo dla nas ważne zjawiska.

Bakterie gramdodatnie i gramujemne

W 1884 roku duński badacz, Christian Gram, zaobserwował, że preparaty mikroskopowe bakterii można wybarwić wypracowaną przez niego metodą w ten sposób, że niektóre komórki mają albo kolor fioletowy, albo różowy. Przez samego Grama nowo odkryta metoda barwienia była wykorzystywana do rozróżniania pneumokoków od Klebsiella pneumoniae.

Christian Gram, w połowie XIX wieku, nie mógł jeszcze wiedzieć nic na temat mechanizmu swojego barwienia, ale dzięki jego odkryciu można obecnie przydzielić wszystkie gatunki bakterii do jednej z dwu grup: bakterii gramdodatnich, barwiących się na granatowo, oraz bakterii gramujemnych, barwiących się na różowo. Zanim zobaczymy, dlaczego tak się dzieje, pozwolę sobie jeszcze na dokonanie pewnej dygresji, mającej wyjaśnić, dlaczego zajmujemy się takimi szczegółami jak kolory komórek bakteryjnych powstające w wyniku jakichś dziwnych manipulacji. Otóż, zwłaszcza, jeśli w chwili gdy to czytasz, jest zima, istnieje duże prawdopodobieństwo, iż gdzieś w szafce leży pudełko z antybiotykami. Weź, drogi Czytelniku, ulotkę dołączoną do opakowania antybiotyku i przeczytaj fragment, opisujący działanie leku. Z pewnością trafisz tam na określenie gramdodatni, gramujemny, a może nawet na obydwa. Christian Gramm z pewnością nie przewidywał, że jego odkrycie może być tak ważne, że będzie miało tak szerokie zastosowanie i że nawet w przypadku leczenia ludzi okaże się mieć olbrzymie znaczenie. W rzeczywistości, barwienie metodą Gramma jest jedną z pierwszych czynności, podejmowanych podczas identyfikacji danego mikroorganizmu.

Barwienie Gramma - podstawy zjawiska

Żeby dobrze zrozumieć podstawy zjawiska, którego efektem jest zróżnicowane wybarwianie się bakterii, prześledźmy krok po kroku metodę barwienia. Przy podawaniu kolejnych kroków od razu dokonywane będą objaśnienia, pozwalające zrozumieć sens takiego, a nie innego postępowania.

• Odtłuszczamy szkiełko podstawowe

Odtłuszczenie jest niezbędne, gdyż proces barwnienia polega na dodawaniu kolejnych roztworów, które powinny równomiernie pokrywać powierzchnię szkiełka podstawowego. Ten etap, podobnie jak dwa następne, występuje przy wykonywaniu prawie każdego preparatu mikrobiologicznego (chyba, że będziemy prowadzić obserwacje przyżyciowe)

• Na odtłuszczonym szkiełku wykonujemy rozmaz bakterii, posługując się ezą i płynem fizjologicznym. Rozmaz należy wysuszyć!!!

• Przy użyciu specjalnych szczypiec przeciągamy preparat trzykrotnie nad płomieniem.

Ten etap ma dwojakie znaczenie. Po pierwsze, bakterie są zabijane - może mieć to pewne znaczenie przy przygotowywaniu preparatów z gatunków patogennych, gdyż powoduje zwiększenie bezpieczeństwa pracy. Po drugie (i to jest zasadniczy cel tego zabiegu), przeciąganie szkiełka nad płomieniem powoduje, że bakterie bardzo silnie do niego przylegają, co zapobiegnie ich zmyciu z powierzchni szkiełka w trakcie kolejnych etapów barwienia. Dlatego mówimy tutaj o utrwaleniu preparatu.

• Utrwalony preparat zalewamy fioletem krystalicznym na 60 sekund

Fiolet krystaliczny jest barwnikiem, który wybarwia wszystkie komórki, zarówno gramujemne, jak i gramdodatnie, na fioletowy kolor. Tak więc gdybyśmy mieli jedynie uwidocznić bakterie, barwienie w zasadzie możnaby było zakończyć na tym etapie. Jednak ze względu na fakt, że nie odróżnimy w ten sposób komórek gramdodatnich od gramujemnych, nie jest to dla nas rozwiązanie satysfakcjonujące

• Po delikatnym spłukaniu barwnika, preparat należy zalać płynem Lugola na 30 sekund

Płyn Lugola to tzw. bejca, czyli specjalny preparat, mający za zadanie utrwalenie wiązania barwnika. W przypadku fioletu krystalicznego po zastosowaniu płynu Lugola tworzą się kompleksy barwnika, w skład których wchodzi jod. Powoduje to oczywiście, że poszczególne cząsteczki różnych związków chemicznych, wchodzące w skład fioletu krystalicznego, zbijają się w agregaty o stosunkowo dużych wymiarach

• Preparat przez 30 sekund odbarwia się w etanolu

Ten etap ma decydujące znaczenie, powoduje on bowiem, że kompleksy barwnika są wypłukiwane z komórek. Jeśli w ścianie komórkowej występują wystarczająco duże pory, barwnik zostaje wypłukany, jednak gdy ściana komórkowa nie jest tak "dziurawa", barwnik pozostaje we wnętrzu komórki. W przypadku komórek gramujemnych, ściana komórkowa złożona jest z jednej warstwy mureiny i barwnik może swobodnie wydostać się z komórki. Jednak w przypadku bakterii gramdodatnich ściana komórkowa ma kilkadziesiąt warstw. Można to wyobrazić sobie jako kilkadziesiąt nałożonych na siebie siatek. Mimo że oka każdej siatki są wystarczająco duże, aby kompleks barwnika mógł wypłynąć z komórki, to po nałożeniu na siebie kilkudziesięciu takich siatek, barwnik nie może już zostać wypłukany. Ponadto etanol powoduje odwodnienie ściany komórkowej, czemu towarzyszy zaciskanie się poszczególnych warstw mureiny i zmniejszanie oczek sieci.

• Po odbarwieniu preparat jest płukany wodą i dobarwiany jakimś uniwersalnym barwnikiem, np. safraniną lub fuksyną

Safranina i fuksyna mają inną barwę niż fiolet krystaliczny. Ponieważ w wyniku płukania komórki gramujemne stają się bezbarwne, a gramdodatnie są fioletowe, dodatkowe barwienie pozwoli na wyraźne zróżnicowanie barwy komórek gramdodatnich i gramujemnych

• Preparat oczywiście oglądamy pod mikroskopem z zastosowaniem zjawiska immersji, co pozwala nie tylko na identyfikację zabarwienia ściany komórkowej, ale także na określenie kształtu badanych komórek.

Powyższy opis tłumaczy, dlaczego kolor komórek gramdodatnich i gramujemnych jest różny w wyniku przeprowadzenia tych samych etapów barwienia - mamy po prostu do czynienia z różnicami w budowie ściany komórkowej (szerzej są one opisane dalej). Musimy jednak zdawać sobie sprawę z faktu, że różnice w budowie bakterii gramdodatnich i gramujemnych to nie tylko różna budowa ściany komórkowej, ale także poważne, o medycznym znaczeniu, różnice w fizjologii tych bakterii.

Z kronikarskiego obowiązku należy także wspomnieć o gatunkach gramchwiejnych, czyli takich, które nie barwią się gramdodatnio lub gramujemnie, lecz są "niezdecydowane". Gramchwiejność może być także przejściowym etapem podczas wzrostu komórki bakteryjnej: jeśli bakterie gramdodatnie rosną szybko (tzn. często się dzielą), komórki potomne mogą nie nadążać z syntezą wielu warstw mureiny - będą więc barwić się jak bakterie gramujemne.Hodowle stare także barwią się na różowo, ponieważ są "braki" w ścianie komórkowej.Gramzmienność ma także odniesienie do promieniowców np.Nocardia coralis.

Ściana komórkowa bakterii gramdodatnich

Bakterie gramdodatnie mają, jak już wspomniano, wielowarstwową ścianę komórkową. Wszystkich warstw jest zwykle ok. 40 i są one ze sobą połączone poprzecznymi wiązaniami. Grubość takiej ściany komórkowej wynosi 20-80 nm. Mureina stanowi od 40% do nawet 90% suchej masy ściany komórkowej. Jednak oprócz mureiny w ścianie komórkowej bakterii gramdodatnich znajdują się także inne związki chemiczne.

Najważniejsze z nich to kwasy tejchojowe, będące polimerami glicerolu i rybitolu, czasami również erytrytolu oraz mannitolu, przy czym poszczególne monomery są połączone wiązaniami fosfodiestrowymi. Ze względu na duże ilości fosforu zgromadzonego w kwasach tejchojowych, brak tego pierwiastka nie pozwala na syntezę tych związków. Wytwarzane są wtedy kwasy tejchuronowe, złożone z utlenionych form cukrów. Niektóre gatunki bakterii nie potrafią wytwarzać obu rodzajów kwasów: produkowane są wtedy albo kwasy tejchojowe, albo tejchuronowe. Kwasy tejchojowe i tejchuronowe przechodzą w poprzek ściany komórkowej - są "wplecione" w mureinę. Podobnie rozmieszczone są kwasy lipotejchojowe, zawierają one jednak dodatkowy komponent tłuszczowy, który zakotwicza je w błonie komórkowej bakterii.

Mimo że kwasy tejchojowe stanowią nawet do 50% suchej masy ściany komórkowej bakterii gramdodatnich, bardzo ważną rolę pełnią polisacharydy oraz białka w niej zawarte. Jest to szczególnie istotne w przypadku bakterii chorobotwórczych, gdyż zarówno białka, jak i powierzchniowe cukry, są silnymi antygenami. Dlatego zmienność ich struktury odpowiada za zmienność serotypową bakterii gramdodatnich. Białka znajdują się głównie na zewnętrznej powierzchni ściany komórkowej bakterii gramdodatnich i mogą pełnić funkcję adhezyn (pozwalając na przyleganie komórki do podłoża lub komórek gospodarza), enzymów i inwazyn (dając bakterii zdolność do wnikania do komórki gospodarza) oraz mogą chronić bakterie przed zlizowaniem przez dopełniacz. Jak widać, funkcje te są w zasadniczy sposób związane z chorobotwórczymi właściwościami danego szczepu bakteryjnego.

Należy także zaznaczyć, że sama mureina różni się w składzie chemicznym pomiędzy bakteriami gramdodatnimi i gramujemnymi. W przypadku bakterii gramdodatnich charakterystyczne jest występowanie w mureinie kwasu LL-diaminopimelinowego lub L-lizyny, nie występuje natomiast kwas mezo-diaminopimelinowy.

Ściana komórkowa bakterii gramujemnych

Ściana komórkowa bakterii gramujemnych zbudowana jest z pojedynczej warstwy mureiny, której towarzyszą dodatkowe związki chemiczne. Istnieją jednak dowody na to, że ściana bakterii gramujemnych może być zbudowana także z 2-3 warstw peptydoglikanu, w którym występuje kwas mezo-diaminopimelinowy i nie występuje lizyna. Skład chemiczny peptydoglikanu może znacznie różnić się od analogicznej struktury u bakterii gramdodatnich - obecnie przyjmuje się, że jedynie u 10-30% bakterii gramujemnych w skład ściany komórkowej wchodzi peptydoglikan o podobnym charakterze chemicznym, co u bakterii gramdodatnich. Niezależnie jednak od tych różnic, grubość ściany wynosi 2-10 nm i nie stwierdza się w niej obecności kwasów tejchojowych.Peptydoglikan "zanurzony" jest w przestrzeni peryplazmatycznej, w której występują także enzymy: rozkładające antybiotyki - beta-laktamaza, enzymy transportujące substancje odżywcze do i z komórki.

Budowa ściany komórkowej bakterii gramujemnych nie jest skomplikowana, gdyż, w odróżnieniu od bakterii gramdodatnich, struktura ta nie kontaktuje się z otoczeniem. Okazuje się bowiem, że w przypadku bakterii gramujemnych ściana komórkowa jest otoczona dodatkową błoną, tzw. błoną zewnętrzną (szerzej zostanie ona przedstawiona dalej). Zatem praktycznie jedyną funkcją ściany komórek gramujemnych jest zapobieganie cytolizie wywołanej zmianami ciśnienia osmotycznego.

Podłoża mikrobiologiczne

Pożywki hodowlane, nazywane też podłożami mikrobiologicznymi, są mieszaninami odpowiednio dobranych składników. Służą do hodowli mikroorganizmów w warunkach laboratoryjnych, w naczyniach (czyli hodowlach in vitro - dosłownie w szkle). Stosuje się je do izolacji, różnicowania, namnażania i identyfikacji mikroorganizmów, poznawania ich cech morfologicznych, fizjologii czy budowy chemicznej komórek. Pożywki mikrobiologiczne są również wykorzystywane w procesach biotechnologicznych do otrzymywania biomasy oraz określonych produktów metabolizmu mikroorganizmów. Tak też hodowle na pożywkach stanowią podstawę nieomal każdego zabiegu w bakteriologii i mikologii oraz dziedzinach na nich opartych.

Pożywki bakteriologiczne, ogólnie mówiąc, powinny być dość łatwe w użyciu i odznaczać się specyficznymi właściwości. Ze względu na wygodę korzysta się obecnie głównie z podłoży stałych, a rzadziej z płynnych, czy półpłynnych. Zestalenie pożywek umożliwiają substancje takie jak agar-agar - pozyskiwany z krasnorostu morszczynu cejlońskiego lub innych, podobnych mu gatunków (typ Rhodophyta w królestwie Protista) polisacharyd, używany z resztą także do wytwarzania pianki w ptasim mleczku. Dawniej stosowano żelatynę (uzyskiwana jest przez podgrzanie białka prostego z grupy kolagenów), która jednak ze względu na swoje zwierzęce pochodzenie egzaminu zdać nie mogła (sama może być skażona drobnoustrojami lub, o czym mówi się od niedawna, odpornymi na zniszczenie prionami). Zestalone podłoża umożliwiły jednemu ze współpracowników Roberta Kocha, także Niemcowi z pochodzenia, J. R. Petriemu wynalezienie dwóch płytkich szalek o promieniu około 5 cm, przy czym tak skonstruowanych, że jedna idealnie nakłada się na drugą (nazywanych z resztą płytkami Petriego: ang. Petri dish). Pierwotnie, przez bardzo długi okres czasu płytki te były wytwarzane ze szkła. Aktualnie szalki Petriego, na które "fabrycznie" wylewane są podłoża mikrobiologiczne wytwarzane są z plastiku, znacznie lżejszego od szkła, co ułatwia manewrowanie nimi.

Jak wspomniano, oprócz podłoży stałych wykorzystuje się czasem także podłoża płynne i półpłynne. Hodowle na tych typach pożywek prowadzi się w probówkach, które nie posiadają górnego kołnierza typowego dla probówek chemicznych. Możliwa (i stosowana) jest także metoda hodowli na podłożach stałych wylanych do probówek. Nie wymaga to jednak specjalnego komentarza, tak też zostanie to omówione w kolejnych dwóch rozdziałach.

Właściwości podłoży umożliwiające wzrost drobnoustrojów

Skład

Wzrost drobnoustrojów nie jest możliwy na podłożach każdego typu. Hodując mikroby wymusza się na nich nieustanne podziały. Owocuje to powstawaniem komórek potomnych (które utworzą po pewnym czasie widzialną gołym okiem kolonię). Organizm bakterii, stanowiący jedną komórkę, zbudowany jest z określonych związków organicznych (głównie białek - a te z aminokwasów). Do ich syntezy niezbędne są pewne pierwiastki, tzw. pierwiastki biogenne ("życiodajne"), do których należy zaliczyć węgiel (którego czterowartościowa forma stanowi podstawę każdego związku określanego, jako organiczny), tlen, wodór, azot, fosfor, siarkę. Niedobór, któregokolwiek z nich (czy innych, bardziej typowych dla gatunku, pierwiastków) zgodnie z prawem minimum Justusa von Liebiga uniemożliwi wzrost drobnoustrojów. Zależnie od zapotrzebowania drobnoustrojów na składniki odżywcze podzielono mikroby na wymagające (wybredne) i niewybredne (niewymagające). ====Odczyn pH i izotoniczność====mm

Posiew

Posiew jest podstawową metodą diagnostyki bakteriologicznej i mikologicznej zarówno w mikrobiologii klinicznej, jak i "badawczej". Najkrócej rzecz ujmując posiew to metoda uzyskania pojedynczych, odosobnionych kolonii bakterii, czy grzybów na podłożach mikrobiologicznych. Metod i sposobów uzyskania tego jest wiele - lecz jedynie kilka jest powszechnie używanych. My przedstawimy 6, dość popularnych metod, którym dla ułatwienia nadamy

nieformalne numery. Metody I-III są metodami "jakościowymi", zaś kolejne dwie pozwalają dość precyzyjnie określić ilość drobnoustrojów w analizowanym materiale. Szósta - ostatnia to metoda, powiedzmy, pomocnicza. Narzędziem obecnie używanym do posiewu są głównie ezy, do niedawna stosowało się także wygięte w kilku miejscach szklane bagietki. Do posiewów, aby uzyskać wiarygodne wyniki, używamy sterylnego sprzętu, a ezy nie powinny być gorące.

Metoda I

"Metoda I" nazywana jest czasem metodą uproszczoną. Metody tej można używać tylko przy wysiewaniu na podłoża stałe.
Główną zaletą tej metody jest jej prostota. Posiew wykonuje się "rysując" ezą wgłębienia w podłożu tak, jak pokazano na poniższym rysunku. Używa się jej głównie przy hodowlach z materiału zawierającego niewiele bakterii (np. z moczu).

Metoda II

Metoda ta jest powszechnie znana, jako posiew redukcyjny. Jej twórcą jest niemiecki geniusz mikrobiologii Robert Koch. Metody tej można używać tylko podczas wysiewania na podłoża stałe.
Posiew redukcyjny jest najpopularniejszą metodą posiewu, na co wpływa jego uniwersalność względem ilości mikroorganizmów w wyjściowej zawiesinie. Istnieje kilka możliwości poprawnego wysiania materiału metodą redukcyjną, nieznacznie różniących się między sobą. My zaproponujemy chyba najprostszą z nich. Sam proces posiewania podzielić można na cztery części. Wygodnie byłoby, szczególnie przy dużej liczbie posiewów, zaopatrzyć się w cztery kolejno ułożone w stojaku (aby nie mieszało się, które są "gorące", a które nie) ezy - po jednej do każdego etapu. Po pobraniu materiału wcześniej wysterylizowaną w płomieniu palnika ezą należy rozprowadzić go po podłożu do około 40% szerokości szalki Petriego w identyczny sposób, jak w przypadku "metody pierwszej" (etap 1). Następnie sterylizujemy użytą ezę, dla wygody obracamy płytkę o 90° i kolejną z rzędu pętlą bakteriologiczną powtarzamy czynność (etap 2). Obracamy znów płytkę Petriego (trzymając się obranego kierunku) i powtarzamy czynności (etap 3). W etapie 4 kolejną ezą poruszamy w taki sposób, aby zmieścić się w górnej części etapu trzeciego i wolnej przestrzeni pośrodku. W tym momencie posiew został zakończony, płytkę możemy włożyć do cieplarki. Sami za to możemy wziąć pierwszą ezę i zacząć wszystko od początku...

Metoda III

Paragraf ten opisuje metody wysiewania na podłoża stałe wylane do probówek. Jest dość dużo możliwości w jakich podłoże (np. agar) może zastygnąć (patrz rysunek).
Z racji braku miejsca na wszystkie manewry niezbędne do wykonania posiewu musimy używać innego, pozbawionego oczka ("pętelki"), typu ezy: tzw. ezy kłutej. Posiew wykonujemy w sposób zbliżony do "metody I".

Jest to metoda dość prosta i, mimo tego, rzadko używana w celu hodowli bakterii. Może być wykorzystywana do prób identyfikacji szczepów na podstawie wyników ich wzrostu na różnego typu podłożach. Niemniej jednak, biochemiczne testy odbywające nieomal bez udziału laboranta są powszechniejsze. Nasza "trzecia metoda", choć wiekowa, dostarczyć może wielu informacji (np. o zdolności do ruchu), których nie można bezpośrednio wywnioskować po automatycznych testach.

Na pożywkach wylanych skośnie bardzo wygodnie hoduje się grzyby - organizmy rosnące zarówno nad, jak i pod powierzchnią pożywki. Nierzadko nie wysiewa się grzybów przyrządami mikrobiologicznymi, lecz po prostu wrzuca do probówki materiał (np. fragmenty paznokcia).

Metoda IV

Metoda czwarta, zwana techniką seryjnych (wielokrotnych) rozcieńczeń, została opracowana w 1878 roku przez angielskiego chirurga, twórcę antyseptyki barona Józefa Listera.
Pozwala ona bardzo dokładnie określić ilość bakterii w wyjściowej zawiesinie. Podstawą metod ilościowych jest prawo mówiące, że z jednej bakterii w roztworze wyjścowym powstaje na drodze podziałów jedna kolonia. Jest metodą wymagającą kilku probówek i przynajmniej 2 płytek z odpowiednim podłożem. Przygotowując materiał do wysiania rozcieńczamy go kilkukrotnie w stosunku 1:10 tak, jak pokazano na rysunku. Zazwyczaj dokonuje się sześciu, siedmiu rozcieńczeń. Następnie pipetą mikrobiologiczną do jałowych końcówek pobiera się materiał z kilku (dwóch, trzech) ostatnich probówek. Następnie pobrany materiał, o określonej objętości rozsiewa się redukcyjnie - "metodą drugą" (oczywiście materiał z każdej końcówki na innej szalce Petriego).

Równie prosto można policzyć ilość mikroorganizmów (z wyhodowanej grupy) w danej jednostce objętości (identycznej z wysianą objętością) wewedług wzoru:

, gdzie

a - liczba kolonii
b - objętość posiania
10^-x - współczynnik rozcieńczenia
W przypadku potrzeby porównania wyników z hodowli, w których pod uwagę brano różne objętości materiału warto skorzystać z (jakże popularnych wśród chemików) proporcji.

Metoda V

Powyższa metoda, choć uniwersalna, jest jednak w stanie (delikatnie mówiąc) dać się we znaki. Nie jest na pewno najszybsza, wymaga wielu operacji, wielu płytek... Czasem, gdy do policzenia mamy niewielką ilości bakterii nie ma sensu korzystać z tego mikrobiologicznego arsenału możliwości. W takiej sytuacji wygodna jest metoda Hoepricha. Do przeprowadzenia hodowli wykorzystując tę metodę będzie potrzebne po 1 płytce Petriego z każdym interesującym nas podłożem, a także eza, o ściśle określonej średnicy oczka - tzw. eza kalibrowana. Metody tej używać można jedynie do wysiewania materiału płynnego. Sterylną ezą kalibrowaną należy pobrać materiał (tak, aby oczko było "pełne"), a następnie rozsiać go metodą pierwszą lub drugą. Przy posiewie redukcyjnym ezy kalibrowanej należy użyć podczas umownego "etapu 1.". W dalszych "etapach", dla wygody, używać możemy zwykłych ez.
Interpretacja wyników jest zależna od średnicy oczka ezy kalibrowanej - zazwyczaj wystarczy pomnożyć ilość kolonii przez 100 lub 1000, aby uzyskać ilość bakterii w 1 mm³ materiału.

Metoda VI

Jako metodę VI (ostatnią) proponujemy technikę wysiewania na podłoża płynne. Metoda ta ma znaczenie pomocnicze - głównie, gdy chcemy uzyskać zawiesinę bakterii z materiału stałego. Możemy to ciało stałe zalać pożywką płynną, a także do pożywki wprowadzić materiał z ezy, czy wacika do wymazów kilkukrotne wkładając i wyjmując narzędzie (najlepiej dotykając przy tym ścianek naczynia). Nastęnie możemy:

• zawiesinę inkubować (wygodne, gdy nie prowadzimy badań ilościowych lub gdy dane ilościowe służą wyłącznie do porównań) po czym wysiać jedną z powyższych metod na płytki Petriego;

• bezpośrednio po zabiegu wysiać jedną z powyższych metod na płytki Petriego.