Składniki buforu wykorzystywanego do niszczenia błon. Wymienić składniki i podać funkcje.
Tris HCl – ma na celu utrzymanie stałego pH
NaCl – utrzymywanie stałego ciśnienia
EDTA – etylenoduaminoczterooctan sodu, chelatuje jony metali ciężkich, które mogą uszkadzaćenzymy stosowane na dalszych etapachdoświadczeń; wiąże jony Mg, który jest kofaktorem większości nukleaz , przez co chroni DNA przed ich działaniem
CTAB – bromek cetylotrimetyloamoniowy, niszczy błony komórkowe, powoduje denaturację białka, funkcja ochronna
Beta-merkaptoetanol – czynnik redukujący, rozbija mostki S-S w białku, powoduje denaturację białka
Wymień etapy PCR
denaturacja DNA
hybrydyzacja (annealing) primerów
elongacja (synteza DNA)
Za pomocą czego oczyszczamy RNA ( pytanie testowe)
Odpowiedź : roztwór chloroformu – mieszanina fenolu i alkoholu izoamylowego
Co to jest immunofluorescencja
Immunofluorescencja jest to podobny test do elisa ale przeciwciała znakowane są barwnikiem fluorescencyjnym
Etapy ELISA
Jest to test enzymatyczno-immunosorpcyjny. Stosuje się w fitopatologii do wykrywania wirusów roślinnych, bakterii i grzybów. Przeprowadza się czteroetapową reakcję:
etap I- opłaszczenie powierzchni studzienki specyficznymi przeciwciałami
etap II – inkubacja antygenu; jeśli jest obecny w badanej próbie, zostaje wychwycony przez przeciwciała zaadsorbowane na powierzchni płytki
etap III – inkubacja koniugatu czyli przeciwciał związanych z enzymem, najczęściej alkaliczną fosfatazą i utworzenie kompleksu przeciwciało-antygen-koniugat
etap IV – wykrywanie obecności enzymu związanego w kompleksie na podstawie reakcji barwnej zachodzącej po dodaniu substratu
Metody fizyczne dezintegracji komórek:
Zamrażanie i rzmrażanie komórek, wywoływanie szoku osmotycznego, ultradźwięki o dobranej częstotliwości i dużym natężeniu
Metody mechaniczne dezintegracji komórek:
rozcieranie w moździerzu, rozdrobnienie tkani przy użyciu homogenizatora lub miksera, (przeprowadza się w obecności szklanych lub metalowych kulek)
Na czym polega wirowanie w gradiencie stężeń
Jest to wirowanie strefowe, badaną zawiesinę nakłada się warstwami na specjalnie przygotowany roztwór sacharozy lub chlorku cezu, którego stężenie zwiększa się stopniowo w kierunku działania siły odśrodkowej, cząsteczki o podobnej gęstości wędrują w postaci pasm i zatrzymują się w określonej fazie, wirowanie takie stosuje się np. do rozdziału mieszanin DNA różniących się składem zasad.
Czym wybarwiamy podczas elektroforezy na żelu agarozowym?
Bromkiem etydyny
Jakie zafałszowania powodują metabolity wtórne?
- hamują reakcje enzymatyczna
- niedokładny pomiar spektrofotometryczny
-zmieniają ruchliwość elektroforetyczna
- przez zwiększoną lepkość błędy w pipetowaniu
powodują degradacje kwasów nukleinowych w czasie przechowywania
Od czego zależy szybkość poruszania się w żelu agarozowym?
natężenia pola elektrycznego
wielkości cząsteczek
stężenia agarozy
składu i siły jonowej buforu użytego do elektroforezy
Wymień bufory wykorzystywane podczas elektroforezy na żelu agarozowym
Do rozdziału dwuniciowego DNA: bufory zawierające EDTA i Tris oraz kwas octowy( bufor TAE-octanowy) lub borowy (bufor TBE-boranowy)
Do rozdziału jednoniciowego DNA: bufor alkaliczny zawierający oprócz EDTA wodorotlenek sodu.
Ocena ilościowa i jakościowa preparatów RNA i DNA
Stęż. można określić spektrofotometrycznie lub w czasie elektroforezy w żelu agarazowym. Przy spektrofoto. Odczytuje się przy 260,280,320 nm. Przy 260nm absorbancja =1 dla 2niciowego DNA o stęż. 50mg/ml, 1niciowego o stęż. 33mg/ml
Stęż. dsDNA – C(mg/ml)=(A260-A320) * 50* rozcieńczenie
Stęż. ssDNA - C(mg/ml)=(A260-A320) * 33* rozcieńczenie
Stęż. RNA - C(mg/ml)=(A260-A320) * 40* rozcieńczenie
Wart.współczynnika A260/A280 pomiedzy 1,8- 2 –preparaty oczyszczone, 1,5 –50% DNA lub RNA i 50% białka, >2- preparat zanieczyszczony
Rodzaje hybrydyzacji na nośniku stałym ( nie trzeba było opisywać ale na wszelki wypadek są opisane bo Panna Kostecka jest nadgorliwa :p)
1. Punktowa- mieszanina DNa lub RNA nie trawiona enzyami restrykcyjnymi i nie rozdzielana elektroforetycznie, jest nakladana na membrane, unieruchamina przez ogrzewanie i naswietlanie promieniowaniem UV, nastepnie wykonuje sie inkubacje z sonda
2. Southerna DNA-DNA polega na identyfikacji poszukiwanych sekwencju DNA na mieszanienie fragmentow otrzymanych po trawienie enzymami restrykcyjnymi, rozdziela sie DNA na zelu agarozowym. Żel ten po elektorforezie poddaje sie denaturacji, rozdzielone nicic DNA przez sączenie kapilarne przenoszone są na filtr nylonowy lub nitrocelulozowy. DNA unieruchomiany na filtrze przy 80 stopnia C jest hybrydyzowany z sonda. Uzyskuje sie dodatkowe informacje o pozycji elektorforetycznej i wilekosci fragmentow kw. nukleinowych
3. Northerna- RNA -DNA wykonynawana podobnie ak southerna, jednak frakcjonowany jest RNA a denaturacja zachodzi przy formamidzie. Dostarcza ta metoda informacji o wystepowaniu w badanych komorkach poszukiwanego RNA
Hybrydyzacja Southerna (pytanie testowe)
Odpowiedź prawidłowa: DNA/DNA
Hybrydyzacja Northrna (pytanie testowe)
Odpowiedź prawidłowa: RNA/DNA
W jakiej temperaturze przeprowadza się elongację
W temp. 70-75
Enzym w teście ELISA jego substrat i produkt
Enzymem w teście ELISA jest fosfataza alkaliczna, substratem p-nitrofenylofosforan i produktem p-nitrofenol
Na czym polega test aglutynacji?
Na szkiełku zegarkowym obserwujemy zlepianie się antygenu z surowicą zawierającą przeciwciała. Można przeprowadzić tez w skali mikro na płytkach Petriego. Temperatura optymalna inkubacji 25 stopni C czas ok. 30 min - 2 godzin. Wyróżniamy też test aglutynacji lateksowej - analog ale antygenem są spłaszczone cząsteczki lateksu.
Wymień enzymy RT PCR
odwrotna transkryptaza , enzymy : AMV - ptasiej mieloblastozy oraz MMLV- mysiej bialaczki
21. Wymień cztery testy serologiczne
-aglutynacji
-precypitacji ( probowkowa, mikroprecypitacji, niespecyficznej precypitacji)
–test podwojnej dyfuzji w żelu agarozowym
–test wiazania dopelniacza
PCR służy do amplifikacji (pytanie testowe)
Odpowiedź prawidłowa: dwuniciowego fragmentu DNA
Wymień barwniki w poliakrylamidzie:
-bromek etydyny
-srebro