Laboratorium 13 P R E P A R A T Y K A K W A S Ó W N U K L E I N O W Y C H

Ćwiczenie 1: Izolowanie RNA z drożdży

1. Zagotuj w zlewce 20mL 2% roztworu soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS).

Uwaga: roztwór silnie się pieni!

2. Do wrzącego roztworu dodaj 5 g rozdrobnionych świeżych drożdży i całość ogrzewaj przez 3 minuty, mieszając zawartość bagietką.

3. Ostudź zawartość zlewki pod strumieniem zimnej wody.

4. Przelej roztwór do probówki wirówkowej i odwiruj przez 10 minut przy 3000 obr./min.

5. Przelej supernatant do kolejnej probówki wirówkowej.

6. Dodaj 20 mL oziębionego 95% etanolu i odstaw na 15 min.

7. Odwiruj próbę przez 10 minut przy 3000 obr./min.

8. Wylej supernatant, a osad rozpuść w 5 mL 0,1 M NaOH i przelej do odpowiedniej buteleczki.

Ćwiczenie 2: Oznaczenie stężenia RNA w preparacie z drożdży na podstawie zawartości rybozy

1. wykonanie krzywej kalibracyjnej

1. Z roztworu standardowego RNA o stężeniu 400 μg/mL przygotuj (używając H₂O dest. jako rozpuszczalnika) roztwory o objętości końcowej v = 1 mL, zawierające RNA o stężeniach: 40, 100, 200, 300 i 400 μg/mL. Do 6 probówki napipetuj 1 mL wody destylowanej (próba ślepa).

2. Następnie do wszystkich probówek dodaj po 1 mL 10% roztworu FeCl₃ w stężonym HCl oraz po 0,4 mL roztworu orcyny.

3. Wymieszaj dokładnie i wstaw probówki na 20 minut do wrzącej łaźni wodnej.

4. Następnie ostudź probówki i dodaj do każdej próby po 5 mL wody destylowanej - dokładnie wymieszaj.

5. Zmierz absorbancję prób przy długości fali λ = 610 nm.

6. Narysuj krzywą kalibracyjną i oblicz współczynnik kalibracji K.

2. oznaczenie stężenia RNA w preparacie z drożdży

1. Preparat RNA z drożdży (wykonany w ćwiczeniu 1) należy rozcieńczyć 10 razy.

2. Do 3 probówek napipetuj po 1 mL rozcieńczonego 10x roztworu RNA, do probówki 3 dodaj 1 mL wody destylowanej (próba ślepa).

3. Następnie do wszystkich probówek dodaj po 1 mL 10% roztworu FeCl₃ w stężonym HCl oraz po 0,4 mL roztworu orcyny.

4. Wymieszaj dokładnie i wstaw probówki na 20 minut do wrzącej łaźni wodnej.

5. Następnie ostudź probówki i dodaj do każdej próby po 5 mL wody destylowanej - dokładnie wymieszaj.

6. Zmierz absorbancję prób przy długości fali λ = 610 nm.

7. Korzystając z krzywej wzorcowej oraz ze współczynnika kalibracji oblicz stężenie RNA w każdej z trzech prób, następnie oblicz średnią arytmetyczną z otrzymanych wartości stężeń. W celu uzyskania stężenia RNA w wykonanym preparacie, uwzględnij rozcieńczenie preparatu.

---