WYZNACZANIE ZMIAN STOPNIA HYDROLIZY BIAŁEK PODCZAS REAKCJI KATALIZOWANEJ ALKALAZĄ

Zagadnienia kolokwialne

1. Zalety i wady stosowania technologii enzymatycznych.

2. Rodzaje preparatów enzymatycznych stosowanych w przemyśle

3. Regulacja reakcji enzymatycznych

4. Przykłady zastosowań preparatów enzymatycznych

5. Oznaczanie DH metodą pH-stat

6. Oznaczanie DH metodą miareczkowania formolowego

7. Alkalaza i jej działanie

8. Istota metody formolowej lub pH -stat

Wprowadzenie

Właściwości hydrolizatów białkowych zmieniają się zależnie od zaawansowania fragmentacji cząsteczek podczas reakcji. Dla uzyskania produktu o pożądanych właściwościach konieczne jest więc zatrzymanie procesu po osiągnięciu pożądanego stopnia hydrolizy (DH), definiowanego jako procentowy udział wolnych grup karboksylowych w hydrolizacie do ich ogólnej zawartości w białku. DH określa wzór:

DH (%) =

w którym N₁ oznacza zawartość wolnych grup karboksylowych w hydrolizacie [µmol/g białka], natomiast N₂ to zawartość wolnych grup karboksylowych w próbce poddanej całkowitej hydrolizie [µmol/g białka]. Całkowitą hydrolizę badanej próbki uzyskuje się po sześciogodzinnym ogrzewaniu białka z 6 M roztworem HCl w temperaturze 105 °C.

Zawartość wolnych grup karboksylowych oznacza się za pomocą miareczkowania formolowego, polegającego na blokowaniu aldehydem mrówkowym grup aminowych znajdujących się w cząsteczkach wolnych aminokwasów i peptydów.

Zablokowane grupy aminowe nie wykazują właściwości zasadowych i wskutek tego aminokwasy oraz peptydy zachowują się jak słabe kwasy, które można miareczkować roztworem wodorotlenku sodu lub potasu w obecności fenoloftaleiny.

Do katalizowania hydrolizy białek często używa się alkalazę, której substancją aktywną jest subtylizyna A (endopeptydaza serynowa), wytwarzana przez bakterie Bacillus licheniformis. Enzym ten hydrolizuje wiązania peptydowe wewnątrz cząsteczki białka i nie przejawia aktywności względem wiązań na N- i C-końcu łańcucha peptydowego. Alkalaza jest enzymem o małej specyficzności, rozszczepiającym wiązania peptydowe pomiędzy resztami różnych aminokwasów. Preparat ten wykazuje największą aktywność w temperaturze 55-60 °C przy pH 8,5. Oporność cieplna wymienionego enzymu maleje w kwaśnym środowisku i przy pH < 4 ulega on inaktywacji już po 30 min ogrzewania w 50 °C, natomiast przy pH < 3 utrata aktywności następuje nawet bez ogrzewania.

W przypadku alkalazy szybką kontrolę stopnia hydrolizy można przeprowadzić rejestrując zmiany kwasowości wywołane (opis do metody pH -stat) rozszczepieniem wiązań peptydowych. Po ich rozpadzie zachodzi wymiana protonu:

- CHR-COOH + H₂N-CHR ↔ CHR-COO^- + ⁺H₃N-CHR

Stopień hydrolizy oblicza się za pomocą wzoru Olsena (1985), na podstawie ilości roztworu NaOH zużywanego do zobojętniania grup -NH₃⁺ podczas utrzymywania stałego pH procesu.

RCH-NH₃⁺ + OH^- → RCH-NH₂ + H₂O

Stosowanie tego sposobu kontroli stopnia hydrolizy nie jest możliwe w przypadku enzymów działających w kwaśnym środowisku w którym niewiele grup aminowych ma ładunek elektryczny (mała wartość α).

Celem ćwiczenia jest wyznaczenie zmian stopnia hydrolizy białek w czasie reakcji katalizowanej alkalazą.

Dośw. I. Enzymatyczna hydroliza białek mięsa i oznaczanie DH metodą pH-stat

• Do 150 g zmielonego mięsa wołowego, drobiu (umieszczonego w zlewce o pojemności 500 ml) dodać 300 ml wody destylowanej.

• Wprowadzić do zlewki elektrodę pH-metru, ogrzać mieszaninę do 55°C w łaźni wodnej i doprowadzić pH do 8,5, stosując 4 M roztwór NaOH i mieszając zawartość zlewki mieszadłem mechanicznym. Objętość roztworu NaOH zużytego do wstępnej regulacji pH należy zanotować.

Uwaga: Najpierw ogrzewamy do 55°C a dopiero później doprowadzamy do pH 8,5. Najpierw dodajecie 4 M roztwór NaOH, mieszacie a dopiero potem pomiar pH (żeby nie przy włączonym mieszadle, uwaga na elektrodę!!!!).

• Do prób dodać 1 ml (1 podgrupa) lub 4 ml (2 podgrupa) alkalazy o aktywności 2.4L i natychmiast rozpocząć pomiary pH wykonywane co 5 min (zegary). Należy utrzymywać temp. 55°C!

• Po każdym pomiarze należy dodać z biurety taką objętość 4 M roztworu NaOH, która spowoduje przywrócenie pierwotnej wartości pH, wynoszącej 8,5. Zanotować objętość zasady dodanej po każdym pomiarze. Podczas pomiarów należy zwrócić uwagę czy zawiesina mięsa nie zakleiła elektrody i w razie potrzeby oczyścić elektrodę.

Pomocna będzie tabela, aby wyznaczyć wykres zmiany stopnia hydrolizy DH od czasu

czas	ilość zużytego NaOH		DH (%)
		podgrupa A	podgrupa B	podgrupa A	podgrupa B
pomiar 0 - wstępna regulacja pH			-
pomiar 1 - po 5 min. od dodania alkalazy
… pomiar 12 - po 60 min.

• Zakończyć pomiary po ok. 1 h (12 pomiarów). Po tym czasie nie powinny już następować istotne zmiany pH.

• Po zakończeniu procesu przeprowadzić inaktywację enzymu przez zakwaszenie produktu do pH 6,5 za pomocą 4 M HCl i zwiększenie temperatury hydrolizatu do 80°C (zagotować próbę).

• Zawartość zlewki przesączyć, zanotować objętość przesączu.

Obliczenia:

DH (%) po każdym pomiarze pH obliczyć korzystając z wzoru: (czyli 12 wyników dla DH%)

DH (%) = (V _* M) / (α _* h _* m_p) _* 100

w którym:

(V) wyrażona w ml objętość 4 M roztworu NaOH zużytego w celu przeciwdziałania zmianom pH podczas procesu, powiększona o objętość NaOH zużytą do poprzedniej regulacji pH substratu,

(M) stężenie molowe NaOH, czyli x 4,

(h) współczynnik zależny od ogólnej ilości wiązań peptydowych w białku, którego średnia wartość dla białek mięsa wynosi 7,6, (m_p) wyrażona w gramach masa białka w próbce, obliczona na podstawie składu podstawowego badanych próbek mięsa, podanego przez prowadzącego ćwiczenie.

(α) w temperaturze 55 °C przy pH 8,5 wynosi 1,6232 jest to stopień dysocjacji: α = 10 ^{pH - pK} / (1 + 10 ^{pH - pK}).

(m_p) ilość białka w mięsie (16g białka na 100g mięsa wieprzowego, 22g białka na 100g mięsa drobiowego

Wyniki należy przedstawić w formie wykresu zależności DH% od czasu. Na jednym rysunku należy przedstawić wykresy z obu grup (rożna zawartość alkalazy) i porównać ich przebiegi.

Dośw. II. Oznaczenie wolnych grup karboksylowych i DH metodą miareczkowania formolowego

• Każda podgrupa bierze 3 kolbki stożkowe 100/150 ml - Pobrać 5 ml hydrolizatu (uzyskanego w doświadczeniu 1), dodać kroplę fenoloftaleiny (pipetką) i doprowadzić próbkę do lekko różowej barwy za pomocą 0,5 M roztworu NaOH.

• Następnie dodać do próbki 5 ml aldehydu mrówkowego (pH 8,5) i po pięciominutowej inkubacji w temperaturze 55°C miareczkować 0,02 M roztworem NaOH aż do lekko różowego zabarwienia. Oznaczenie wykonać w trzech powtórzeniach (ale nie wyciągamy średniej!!!!, tylko dla każdej zużytej objętości 0,02 M NaOH obliczyć zawartość wolnych grup karboksylowych z zależności, a potem z otrzymanych wyników obliczyć średnią zawartość grup karboksylowych - to samo podejście dla prób poddanych całkowitej hydrolizie).

• Tak samo oznaczyć zawartość wolnych grup karboksylowych w dostarczonych przez prowadzącego próbkach poddanych całkowitej hydrolizie w środowisku 6 M HCl. Należy pobrać 5 ml roztworu poddanego całkowitej hydrolizie, dalsza procedura jak wyżej.

Hydrolizaty te przygotowano umieszczając 1 g mięsa w szczelnie zamykanych probówkach z teflonową zakrętką (probówki 20 ml ze szlifem). Do próbek dodano następnie 10 ml 6 M roztworu HCl i prowadzono reakcję przez 6 godz. w temperaturze 105°C. Oziębione próbki rozcieńczono niewielką ilością wody destylowanej (10 ml) i przesączano przez węgiel aktywny do kolby miarowej o pojemności 200 ml. Hydrolizat zobojętniono 2 M roztworem NaOH (wobec kropli fenoloftaleiny) i dopełniono kolbkę wodą destylowaną do objętości 200 ml.

Obliczenia:

Obliczyć zawartość wolnych grup karboksylowych wiedząc, że 1 ml 0,02 M roztworu NaOH reaguje z 20 μmolami kwasu karboksylowego.

Dane do obliczeń (N₁): objętość próby (5 ml), końcowa objętość hydrolizatu (np. 450 ml), naważka mięsa (150 g), ilość zużytego tiranta (ml 0,02 M roztworu NaOH)

Dane do obliczeń (N₂): objętość próby (5 ml), objętość hydrolizatu (200 ml), naważka mięsa (1g), 0,02 M roztworu NaOH

Należy obliczyć 3 x N₁ oraz N₂ i dopiero wtedy wyciągnąć średnią!

Stopień hydrolizy należy obliczyć korzystając ze wzoru:

DH (%) = (N₁ / N₂) _* 100 %

w którym:

(N₁) zawartość wolnych grup karboksylowych w hydrolizacie po metodzie pH-stat (µmol/g produktu),

(N₂) zawartość grup karboksylowych w próbce po całkowitej hydrolizie (µmol/g produktu)

Porównać wartości DH (%) oznaczone metodą pH-stat i miareczkowania formolowego, wyjaśnić przyczyny ewentualnych różnic.

Podstawy Biotechnologii

Ćwiczenie 2

Opracował Piotr Szweda

4

N₁

N₂

x 100 %

Zablokowana grupa aminowa

O

H

H

C

C

H₂N

COOH

H

R

+

C

N

COOH

H

R

H₂C

+

H₂O

---