1. Tytuł: „ Analiza sanitarna wody”

2.

4. Cel ćwiczenia : "określenie czy w wodzie z Kłodnicy występują bakterie kałowe, i wnioskowanie o klasie czystości tej wody"

5 Wstęp teoretyczny

We wstępie teoretycznym chciałybyśmy zamieścić podstawowe informacje na temat bakterii których obecność będziemy potwierdzać lub wykluczać w wodzie z Kłodnicy: o raz podział na klasy czystośći wód ze względu na obecność bakterii typu kałowego.

Pałeczki rodzaju Escherichia fakultatywnie tlenowe, Gram-ujemne bakterie - (należą do Enterobacteriaceae) są bardzo rozpowszechnione w przyrodzie. Spotyka się je w roślinach, glebie, wodzie, ściekach. U człowieka i zwierząt żyją w przewodzie pokarmowym jako symbionty, ale w pewnych warunkach mogą wywołać różne schorzenia, nierzadko śmiertelne. Należy tu m.in. gatunek Pałeczka okrężnicy - Escherichia coli . Nie wytwarzają one przetrwalników. Spotyka się je w ziemi, w jelicie człowieka i zwierząt, a do ścieków trafiają wraz z wydzielinami i z kałem. Ich obecność w wodzie świadczy o zanieczyszczeniu jej kałem. Mogą być przyczyną szerzenia się durów lub czerwonki. U człowieka pałeczka okrężnicy może wywołać stany zapalne dróg moczowych (miedniczek nerkowych i pęcherza), dróg żółciowych (woreczka żółciowego i przewodów żółciowych), zapalenie opon mózgowych, posocznice, otrzewnej, opon mózgowo - rdzeniowych uważa się ją także za przyczynę biegunek u dzieci (odmiana neapolitańska. Escherichia coli wytwarza jady działające m.in. na układ nerwowy (neurotropowy), błonę śluzową przewodu pokarmowego (enterotropowy) i hemolizynę Virella).

Bakterie psychrofilne i mezofilne.

W skład bakterii występujących w powietrzu wchodzą różne rodzaje i gatunki tych mikroorganizmów. Biorąc pod uwagę ich wymagania temperaturowe dzielimy je na mezofilne i psychrofilne. Optimum wzrostu dla bakterii psychrofilnych wynosi około 20°C. Ich temperatura minimalna zbliża się do temperatury zamarzania środowiska, co mechanicznie hamuje rozwój bakterii. Temperatura maksymalna waha się od 25 do 30°C. Do grupy bakterii mezofilnych zaliczamy większość saprofitow i wszystkie drobnoustroje pasożytnicze. W zależności od gatunku bakterii optimum wzrostu waha się od 20 do 40°C; dla większości bakterii chorobotwórczych dla człowieka i zwierząt stałocieplnych zbliża się do temperatury organizmu, tj. około 37°C. Temperatura minimalna waha się zwykle od 10 do 25°C, a maksymalna od 40 do 45°C.

Podział na klasy czystości ze względu na miano coli (najmniejsza objętość w której jeszcze znajdujemy bakterie Escherichia, w naszym przypadku najmniejsze rozcięczenie dla którego reakcja identyfikacyjna będzie pozytywna):

• I 1,0 i powyżej

• II 0.1 i powyżej,

• III 0.01 i powyżej

6. Metody badań:

1. Posiew wstępny do probówki z podłożem Ejkmana (podłoże laktozowe z barwnikiem i z rurką Durhama w probówce) i posiew wgłębny na sterylne płytki agarowe (psychrofile i mezofile)

2. badanie potwierdzające: siejemy na Endo (podłoże laktozowe z fuksyną) i wykonujemy rozcieńczenia i infekujemy probówki z żółcią wołową(z rurkami Durhama) (symuluje warunki w jelitach).

3. po 24h określamy miano (najmniejsze rozcieńczenie w którym jeszcze reakcja jest pozytywna) siejemy z rozcieńczenia (dla naszej sekcji będzie to)10^-3 siejemy na Endo posiewem sektorowym (redukcyjnym) i do zieleni brylantowej. Odczytujemy z mezofili

4. posiew rysowy z Endo (pobieramy pojedynczą kolonię) na skosy agarowe

5. siejemy na szereg biochemiczny (dwa razy podłoże Clarka, raz woda peptonowa z tryptofanem i raz skosy agarowe)

6. odczytujemy z szeregu (przeprowadzamy potrzebne reakcje) i barwimy (przygotowany przez nas preparat) metodą Grama.

• test na wytwarzanie indolu (do probówki na wodzie peptonowej z tryptofanem dolać kilka kropli odczynnika Ehrlicha, nie mieszamy!)

• test na zakwaszenie (do podłoża Clarka dodajemy czerwień metylową)

• reakcja Voges-Proskactera (badamy czy na podłożu Clarka znajduje się acetoina, do podłoża dodajemy 0,6cm³ ά-naftolu + 0,4 cm³KOH i wstawiamy na 30-45 minut do łaźni wodnej ustawionej na 37stopni Celsjusza)

• test na obecność oksydazy cytochromowej (skos agarowy)

7. Wyniki analiz

Pożywka i badanie	Czas inkubacji	Temperatura inkubacji [w stopniach Celsiusza]	Obserwacje lub reakcje charakterystyczne	Odczyt (wynik)
Badanie wstępne na podłożu Ejkmana	24h	37	Zmiana barwy z zielonej na żółtą	Zakwaszenie będące przyczyną zmiany barwy wskazuje na bakterie kałowe
Psychrofile	Sprawdzane za każdym pobytem w laboratorium	Pokojowa, ok. 20	Płytka przerośnięta biomasą	Pozytywny, w próbie wody występowały psychrofile
Mezofile	Sprawdzane za każdym pobytem w laboratorium	37	Płytka przerośnięta biomasą	Pozytywny, w próbie wody występowały mezofile
Badanie potwierdzające na podłożu Endo	24h	44	podłoże zmieniło kolor na różowy a w miejscach zainfekowanych ezą wyrosły kolonie bakterii o metalicznym kolorze	pozytywny
Zieleń brylantowa	24h	37	Zmętnienie, brak gazu w rurce	Próba wątpliwa przedłużamy okres inkubacji.
Posiew rysowy na skosy agarowe	Po 4 dniach (siane w piątek odczyt w poniedziałek)		Wzrost na pożywce	pozytywny
Zieleń brylantowa	Po 4 dniach	37	Zmętnienie, nadal brak gazu w rurce	Próba wątpliwa
Posiew na Endo metodą izolacji czystych kultur	Po tygodniu	44	podłoże zmieniło kolor na różowy a w miejscach zainfekowanych ezą wyrosły kolonie bakterii o metalicznym kolorze	pozytywny
szereg biochemiczny
test na zakwaszenie, odczyn MR, Podłoże Clarka	Po tygodniu	37	Czerwona barwa	pozytywny
Test na wytwarzanie indolu, podłoże z tryptofanem	po tygodniu	37	Pojawia się malinowa obrączka	pozytywny
Podłoże Clarka, Reakcja VP	Po tygodniu	37	Czerwona obwódka	pozytywny
Skosy agarowe (zdolność do wykorzystywania cytrynianu)	Po tygodniu	37	Skosy nie odbarwiły się (nie powstała oksydaza cytochromowa)	negatywny

Barwienie metodą Grama.

Wynik: Bakterie Gram

Obserwacje mikroskopowe:

Oglądamy preparat pod imersją, możemy zauważyć komórki o kształcie……….

8. Wnioski:

Z naszych pozytywnych wyników dla podłoża Endo, odczynu MR, reakcji VP, i na wytwarzaniu indolu na podłożu tryptofanowym oraz tego, że na skosach nie powstała oksydaza cytochromowa świadczą o obecności w wodzie pobranej z Kłodnicy komórek Escherichia coli.

Niejednoznaczna próba z zielenią brylantową najprawdopodobniej była spowodowana, konkurencją ze strony innych mikroorganizmów, które mogły zużywać np. gaz którego nie zaobserwowaliśmy, do własnych przemian metabolicznych (posiew na zieleń był wykonany przed przesiewaniem redukcyjnym na Endo, który wykluczył by inne bakterie).

W próbce wody żyły też bakterie psychro i mezofilne, a po przerośnięciu płytek możemy stwierdzić, że żyją one w Kłodnicy w dużej liczebności.

Pojawienie się pałeczek okrężnicy w wodzie może wskazywać również na obecność w Kłodnicy innych mikroorganizmów chorobotwórczych.

Po przyrównaniu miana coli jakie uzyskaliśmy doświadczalnie z tabelą norm dla zanieczyszczenia biologicznego wody, okazuje się że woda w Kłodnicy nie okazuje się wodą klasy trzeciej, w której nie można się kąpać, pić ani wykorzystywać w przemyśle spożywczym, ani w hodowli zwierząt.

Na podstawie tego że w Kłodnicy bakterie typu kałowego występują w dużych ilościach możemy wnioskować że do rzeki dostaje się woda zanieczyszczona fekaliami, np. spływa z upraw nawożonych obornikiem, źle zabezpieczonych szamb i niestety czasem celowo spuszczanych do wody zamiast odprowadzanych na oczyszczalnię.

Stanowi to duże zagrożenie ponieważ jak już wcześniej wspomniałyśmy obecność Escherichi coli sygnalizuje nam obecność innych patogenów w wodzie.

---