BIOCHEMIA I

POMPY PROTONOWE ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO - LOKALIZACJA, INHIBITORY

Wychwytywanie większości energii pochodzącej z tkankowych procesów utleniania następuje wewnątrz mitochondrium. Proces wytwarzania ATP sprzężony z oddychaniem to fosforylacja oksydacyjna.

Utlenianiu większości składników pokarmu towarzyszy wytwarzanie równoważników redukujących (2H), które są zbierane przez łańcuch oddechowy w celu ich utlenienia i sprzężonego z tym wytwarzania ATP. Mitochondria zawierają zespół katalizatorów, znany jako łańcuch oddechowy. Składniki łańcucha oddechowego są uporządkowane w kolejności wzrastających potencjałów redoks (różnica potencjałów redoks od NAD⁺/NADH do O₂/2H₂O wynosi 1,14 V).

Składniki łańcucha oddechowego są zgrupowane funkcjonalnie i strukturalnie w wewnętrznej błonie mitochondrialnej w 4 lipidowo-białkowe kompleksy, z których każdy zajmuje całą grubość błony.

Mechanizm sprzężenia utleniania z fosforyzacją ADP wyjaśnia TEORIA CHEMIOSMOTYCZNA (Mitchell): energia z procesów utleniania przenośników w łańcuchu oddechowym prowadzi do gromadzenia jonów wodorowych, które są wyrzucane na zewnątrz sprzęgającej błony mitochondrialnej, tzn. błony wewnętrznej. Różnica potencjałów elektrochemicznych, wynikająca z asymetrycznego rozmieszczenia jonów wodorowych jest zużywana następnie do napędzania mechanizmu odpowiedzialnego za tworzenie ATP.

Pierwotna pompa protonowa funkcjonuje w wyniku sprzężenia utleniania z przemieszczeniem protonów z wewnętrznej na zewnętrzną powierzchnię błony. To przemieszczenie H⁺ prowadzą współdziałające ze sobą kompleksy białkowe łańcucha oddechowego: I (oksydoreduktaza NADH-Q), III (oksydoreduktaza Q-cytochrom c) i IV (oksydaza cytochromowa), z których każdy działa jako pompa protonowa.

Syntaza ATP, transportująca H⁺, działa jako wtórna pompa protonowa warunkująca fosforyzację.

Harper ryc. 14-10

Związki rozprzęgające, takie jak 2,4-dinitrofenol, dinitrokrezol, pentachlorofenol, CCCP, termogenina powodują „przeciek” H⁺ przez błonę, skutkiem czego jest zanik elektrochemicznego gradientu protonów. Są to związki amfipatyczne i zwiększają przepuszczalność wewnętrznej błony mitochondrialnej dla protonów. Zmniejszają w ten sposób błonowy potencjał elektrochemiczny i wywołują „krótkie spięcie” w syntazie ATP.

Oligomycyna (antybiotyk), dicykloheksylokarbodiimid swoiście blokują transport H⁺ przez F_o .

Nie jest znana dokładna liczba protonów przepompowywanych przez każdy z kompleksów, przypadająca na każdą cząsteczkę utlenianego NADH. Aktualne pomiary sugerują, że kompleks I przepompowuje 4, kompleksIII z kompleksem IV przepompowują 6 protonów. Natomiast na każdą cząsteczkę ATP „eksportowanego” z mitochondriów przypadają 3 lub 4 protony pobierane przez mitochondria.

INHIBITORY

1) Barbiturany (np. amobarbital)

Pierycydyna A (antybiotyk)

Rotenon (środek owadobójczy)

Amytal

blokują przepływ e między Fe:S a CoQ;

hamują transport e przez oksydoreduktazę NADH-Q i dlatego uniemożliwiają
wykorzystanie NADH jako substratu

2. BAL (dimerkaprol)

Antamycyna A

Hamują łańcuch oddechowy między cytochromem B a cytochromem C

3. H₂S, CO, cyjanki, azydki

Klasyczne trucizny hamujące oksydazę cytochromową (mogą całkowicie uniemożliwić oddychanie)

SYNTAZA GLIKOGENOWA - BUDOWA, MECHANIZM DZIAŁANIA

Syntaza glikogenowa jest jednym z trzech enzymów biorących udział w syntezie glikogenu.

W 1-szym etapie syntetyzowana jest UDP-glukoza z UTP i glukozo-1-fosforanu w reakcji katalizowanej przez pirofosforylazę UDP-glukozy.

Następnie SYNTAZA GLIKOGENOWA, występująca w wątrobie i mięśniach zwierząt, używa UDP-glukozy jako substratu do syntezy glikogenu, dodając pojedyncze reszty glikozylowe do grup C4 OH nieredukującego końca cząsteczki glikogenu i tworząc wiązanie α-1,4-glikozydowe między sąsiadującymi resztami. Enzym może tylko wydłużać już istniejący łańcuch, dlatego do rozpoczęcia syntezy konieczny jest inicjator (primer) o nazwie glikogenina - białko zawierające 8 reszt glukozy połączonych wiązaniami α-1,4-glikozydowymi, które sama przyłącza do siebie (autokataliza). Do tej cząsteczki syntaza glikogenowa dołącza dalsze reszty glikozylowe i tak wydłuża łańcuch. Każde ziarno glikogenu w swoim rdzeniu zawiera jedną cząsteczkę glikogeniny. To, że synteza glikogenowa jest w pełni aktywna tylko podczas kontaktu z glikogeniną, ogranicza rozmiar ziaren glikogenu.

UDP-glukoza + glikogen (n reszt) → UDP + glikogen (n+1 reszt)

Rozgałęzienia w glikogenie tworzy enzym rozgałęziający [amylo-(1,4→1,6)transglikozylaza, który zrywa w łańcuchu glikogenowym wiązania α-1,4 i przenosi fragmenty zbudowane z około 7 reszt ku wnętrzu cząsteczki, wiążąc je z głównym łańcuchem wiązaniem α-1,6. Rozgałęzienia te są ważne, ponieważ enzymy, które rozkładają i syntetyzują glikogen (syntaza i fosforylaza glikogenowa) pracują tylko przy końcu cząsteczki glikogenu. Dlatego istnienie wielu zakończeń pozwala na znacznie szybszą syntezę i rozkład, niż byłoby to możliwe z polimerem nierozgałęzionym.

Syntaza glikogenowa występuje jako ufosforylowana nieaktywna forma b oraz zdefosforylowana aktywna forma a. W mięśniach w stanie spoczynku duże stężenie glukozo-6-fosforanu aktywując syntazę b stymuluję syntezę glikogenu, natomiast podczas skurczu mięśnia enzym jest nieaktywny ze względu na małe stężenie glukozo-6-fosforanu. Kineza białkowa A przez fosforyzację przekształca formę a w b.

Gdyby synteza i rozpad glikogenu miały możliwość równoczesnego działania, efektem netto byłaby hydroliza UTP (tzw. cykl daremny). Kontrola, aby nie doszło do takiej sytuacji, przebiega w drodze allosterycznej regulacji modyfikacji kowalencyjnych, kontrolowanej przez hormony, zarówno syntazy glikogenowej, jak i fosforylazy.

Synteza glikogenowa jest regulowana przez Ca ²⁺ zależne białko kalmodulinę.

Insulina pobudza glikogenogenezę (wzrost defosforylacji).

Harper ryc. 20-7

DOJRZEWANIE rRNA

Frakcja rRNA stanowi składnik rybosomów, w których odbywa się proces biosyntezy białka. Prekursory rRNA tworzą się u prokariotów przez transkrypcję od razu całego odcinka DNA zawierającego wszystkie informacje. Stanowi on sekwencję o ok. 10% dłuższą od kolejno w nim powiązanych frakcji 16S, 23S i 5S. W obrębie tego samego odcinka DNA znajduje się też informacja o jednej, czasem dwóch, sekwencjach tRNA. rRNA i tRNA są syntetyzowane w postaci cząsteczek prekursorowych, podlegających po transkrypcji procesom dojrzewania z udziałem specyficznych rybonukleaz.

W komórkach eukariotycznych transkrybują się razem tylko frakcje 18S i 28S, również z ok. 10%-ową dodatkową sekwencją, natomiast frakcje typu 5S tworzą się oddzielnie. Przemiana pre-rRNA w formy aktywne polega na wielostopniowych procesach cięcia wiązań przez specyficzne nukleazy, w wyniku czego odłączają się sekwencje balastowe i rozdzielają 3 podstawowe frakcje rRNA oraz tRNA. Dojrzewanie rRNA obejmuje również tworzenie kompleksów z białkami, przyjmowanie struktur „spinki do włosów” oraz metylacje nukleotydów.

W organizmach prokariotycznych do wytworzenia dojrzałych czynnościowo cząsteczek jest niezbędne przekształcenie prekursorowych cząsteczek rRNA i tRNA.

W komórkach ssaków 3 cząsteczki rRNA są przepisane jako część pojedynczej dużej cząsteczki prekursorowej. Cząsteczka prekursorowi jest następnie na terenie jąderka przekształcana, w wyniku czego powstają składowe RNA dla podjednostek rybosomów znajdujących się w cytoplazmie. Geny rRNA są umiejscowione w jąderkach komórek ssaków, setki kopii genów w każdej komórce.Jest to potrzebne do biosyntezy dostatecznej liczby kopii dla każdego rodzaju rRNA, aby wytworzyć 10⁷ rybosomów potrzebnych do każdego cyklu replikacyjnego komórki..Podczas gdy pojedyncza cząsteczka mRNA może służyć do skopiowania 10⁵ cząsteczek białka, co jest olbrzymim zwielokrotnieniem, rRNA jest produktem końcowym.

RYC. 39-15 Harper i tekst str. 548

Transkrypt pierwotny ma wielkość 45S i ok. 13000 nukleotydów długości. Jest on syntetyzowany od 5' w kierunku 3' przez polimerazę I RNA. Gęsto upakowane geny są szybko transkrybowane, przez co wydłużające się cząsteczki RNA są łatwo widoczne na preparatach chromatyny i w mikroskopie elektronowym przypominają „drzewka”. Końcowe produkty tworzą się dzięki kilku reakcjom mendo- i egzonukleazy. Formy dojrzałe to 28S, 18S i 5,8S.

Cząsteczka 18S rRNA wlączona jest do mniejszej podjednostki rybosomalnej. Cząsteczki 28S i 5,8S r RNA stanowią składowe większej podjednostki.

BIOCHEMIA II

RYBOSOMY - BUDOWA I FUNKCJA

Rybosomy są drobnymi strukturami wewnątrzkomórkowymi o średnicy 0,02 µm, zbudowanymi z ok. 35% białka i 65% RNA, w powiązaniu z którymi odbywa się biosynteza białka.

Są to „molekularne maszyny” koordynujące pracę tRNA, mRNA i białek w procesie syntezy polipeptydów. Badania: mikroskopia elektronowa o dużej rozdzielczości i metody krystalografii rentgenowskiej.

Znane są 2 typy rybosomów:

1. Większe, o wielkości 80S, występujące w komórkach eukariotów, o masie 4200 kDa

2. mniejsze, o wielkości 70S, charakterystyczne dla prokariota oraz dla organelli eukariota, zdolnych do samodzielnej syntezy białka (mitochondria, chloroplasty), o masie 2700 kDa.

W komórce bakteryjnej jest ok. 20000 rybosomów, co stanowi prawie ¼ masy komórki

Przy charakterystyce rybosomów zamiast masy podaje się współczynniki sedymentacji.

Podczas wirowania przy b. wysokich obrotach - współczynnik sedymentacji zależy od wielkości, kształtu i gęstości cząstki, podawany jest w jednostkach Svedberga (S)

Oba typy zbudowane są z 2 nierównych podjednostek: u prokariota o wielkości 30S i 50S, u eukatiota 40S i 60S.

Podjednostka 50S zawiera 2 rodzaje rRNA 23S i 5S oraz 34 polipeptydy (białka L1 - L34).

Podjednostka 30S zawiera 16S rRNA i 21 polipeptydów (S1-S21).

Rybosom zawiera po jednej kopii każdego rodzaju RNA , po 2 kopie L7 i L12 i po jednej kopii pozostałych białek. L7 i L12 różnią się tylko obecnością grupy acetylowej na końcu N białka L7. Tylko jedno białko jest identyczne w obu podjednostkach: S20 jak L26.

Obie podjednostki można ponownie złożyć in vitro - przykład zasady, że wielkocząsteczkowe kompleksy mogą się odtwarzać spontanicznie ze swoich składników.

W skład podjednostki 60S u eukariotów wchodzą 3 cząsteczki rRNA 5S i 28S będące odpowiednikami prokariotycznych 5S i 23S oraz 5,8S występujący tylko u eukariotów oraz ok. 49 polipeptydów.

Mniejsza podjednostka 40S zbudowana jest z 18S rRNA (homologiczny do prokariotycznego 16S r RNA) i ok. 33 polipeptydów.

Białka wyizolowane z rybosomów mają masy cząsteczkowe 10-65 kDa, w większości ok. 16kDa. Niektóre z białek rybosomalnych „zakotwiczają” mRNA czy aminoacylo-tRNA, inne mają określone aktywności enzymatyczne, względnie regulacyjne, potrzebne w tym procesie.

W komórce rybosomy występują swobodnie w ilości 5000 - 50000 lub są związane z zewnętrzną powierzchnią błon retikulum endoplazmatycznego i nie wykazują specjalizacji do rodzaju syntetyzowanego białka.

W trakcie procesu biosyntezy białka (i przy wyższym stężeniu jonu Mg²⁺) rybosomy mogą grupować się w zespoły (asocjacja do 20 sztuk) zwane polirybosomami (polisomami), biorące udział w procesie tłumaczenia pojedynczej cząsteczki mRNA..

Polirybosomy przyłączone do błon cytoplazmy tworzą szorstką siateczkę śródplazmatyczną, która służy do syntezy integralnych białek błon i białek które będą wydzielone z kom.órki. Struktury polirybosomalne znajduj ą się także w cytoplazmie w postaci wolnej; zachodzi na nich synteza tych białek, które pozostaną w obrębie komórki.

U prokariotów

Rybosom wiąże się z cząsteczką mRNA i odczytuje sekwencję nukleotydów w kierunku 5'→3', syntetyzując z aminokwasów odpowiednie białko od końca aminowego w kierunku końca karboksylowego.

Każdy prokariotyczny rybosom ma 3 miejsca wiązania tRNA:

Miejsce wiązania aminoacylo-tRNA (miejsce A) to miejsce gdzie w czasie elongacji zastaje związany wprowadzony aminoacylo-tRNA.

Miejsce wiązania peptydylo-tRNA (miejsce P) to rejon gdzie zostaje związany tRNA z przyłączonym rosnącym łańcuchem polipeptydowym.

Miejsce wyjścia (miejsce E) jest rejonem wiązania tRNA, który odegrał już swoją rolę w translacji i zostanie uwolniony z rybosomu.

U eukariotów

Główna różnica między inicjacją translacji ; u prokariotów występuje sekwencja Sine-Calgarno umieszczona w rejonie 5' w stosunku do kodonu inicjującego AUG. Sekwencja ta jest miejscem wiazania podjednostki rybosomowej 30S i definiuje kodon służący inicjacji translacji. Kompleks inicjujący tworzy się wprost „nad” kodonem inicjującym.

W większości eukariotycznych mRNA brak sekwencji Sine-Dalgarno. Podjednostka rybosomowa 40S wiąże się z końcem 5' mRNA i porusza się wzdłuż mRNA aż napotka inicjujący kodon AUG (skanowanie). W przypadku niektórych wirusów np. polio w czasie translacji RNA przez komórkę gospodarza eukariotyczne rybosomy wiążą się z wewnętrznym miejscem wiązania rybosomu (IRES) których funkcja jest podobna do funkcji sekwencji Sine-Dalgarno.

Masa rybosomu jest ok. 650 razy większa od masy cząsteczki hemoglobiny.

BIOSYNTEZA AMIN BIOGENNYCH

Aminy biogenne o dużej aktywności biologicznej, tj. histamina, serotonina, melatonina i aminy katecholowe, tj. DOPA, dopomina, noradrenalina i adrenalina - substancje sygnałowe (mediatory) powstają w wyniku dekarboksylacji aminokwasów (wydziela się CO₂ i powstaje amina). Enzymy katalizujące odłączanie grupy karboksylowej od aminokwasów, zwane dekarboksylazami aminokwasowymi, należą do klasy liaz i są rozpowszechnione zwłaszcza wśród bakterii, ale występują też w innych organizmach. Specyficzność dekarboksylaz względem określonego aminokwasu jako substratu jest duża (manometryczne oznaczanie w hydrolizacie białkowym poszczególnych aminokwasów - uwolniony CO₂ ).

Dekarboksylazom aminokwasowym, podobnie jak aminotransferazom, potrzebny jest współudział 5-fosforanu pirydoksalu, z którym aminokwasy tworzą również połączenie typu zasady Schiffa.

Obok ważnych biochemicznie produktów pośrednich w syntezie hormonów i innych związków czynnych np. koenzymów, koenzymów przemianie tej powstają również substancje toksyczne charakterystyczne dla procesów gnicia.

Do amin o charakterze hormonów, lub produktów przejściowych przy ich syntezie, należy np. histamina - produkt dekarboksylacji histydyny (enzym dekarboksylaza histydynowa, występujący w większości tkanek), stymulująca m.in. wydzielanie soków trawiennych.

Enzym dekarboksylaza L-aminokwasów aromatycznych - o rozległej swoistości (histydyna, dopa, 5-hydroksytryptofan,fenyloalanina, tyrozyna, tryptofan).

Dekarboksylacja tyrozyny - tyramina

dihydroksyfenyloalaniny - hydroksyfenyloetyloamina, jeden z końcowych produktów pośrednich biosyntezy hormonu rdzenia nadnercza adrenaliny (epinefryny)

tryptofanu - tryptamina

5-hydroksytryptofan - serotonina (neuroprzekaźnik) zwężająca naczynia krwionośne i stymulująca skurcze mięśni gładkich (hydroksylację tryptofanu do 5-hydroksytryptofanu katalizuje hydroksylaza tyrozynowa wątroby)

treoniny - 2-propanoloamina, składnik koenzymu B₁₂

cysteiny - cysteamina, składnik koenzymu A

asparaginianu - 3-alanina, jw.

seryny - etanoloamina, składnik fosfolipidów

kwasu glutaminowego - kwas 4-aminomasłowy, przenośnik impulsów nerwowych (GABA)

Produkty gnilne - putrescyna i kadaweryna (tetra- i pentametylenodiaminy) powstają z aminokwasów zasadowych ornityny i lizyny.

Konwersja tyrozyny do adrenaliny (aminy katecholowe - mające grupę dihydroksyfenylową, powstają w rdzeniu nadnerczy i w ośrodkowym układzie nerwowym):

1. hydroksylacja pierścienia benzenowego→Dopa (dihydroksyfenyloalanina), enzym hydroksylaza tyrozynowa

2. dekarboksylacja→Dopamina, enzym dekarboksylaza Dopa

3. hydroksylacja łańcucha bocznego→Noradrenalina, enzym ß-hydroksylaza dopaminowa

4. N-metylacja→adrenalina, enzym N-metylotransferaza fenyloetanoloaminy (PNMT)

Aminokwasy są prekursorami wielu innych cząsteczek biologicznych, np. puryn i pirymidyn, glutationu, tlenku azotu (powstająca z argininy cząsteczka sygnałowa), porfiryny.

Warto zwrócić jeszcze uwagę na przemiany fenyloalaniny .

FOSFATAZY - UDZIAŁ W METABOLIZMIE KOMÓRKOWYM, REGULACJA AKTYWNOŚCI

Katalityczne właściwości wielu enzymów zmieniają się zasadniczo w wyniku kowalencyjnego przyłączenia grupy modyfikującej, którą najczęściej jest grupa fosforanowa. W reakcjach tych donorem grupy fosforanowej jest ATP, są one katalizowane przez kinezy białkowe. Usuwanie grupy fosforanowej na drodze hydrolizy jest katalizowane przez fosfatazy białkowe.

Uniwersalnym sposobem przekazywania informacji to fosforyzacja białek. Wiele cząsteczek sygnałowych drugiego rzędu wywołuje odpowiedź w wyniku aktywacji kinaz białkowych,które przenoszą grupy fosforanowe z ATP na określone reszry seryny, treoniny i tyrozyny w białkach. Chociaż zmiany te nie są tak tymczasowe jak zmiany stężenia cząsteczek sygnałowych drugiego rzędu, fosforyzacja białek nie jest nieodwracalna. Enzymami usuwającymi specyficzne grupy fosforanowe ze zmodyfikowanych białek w drodze hydrolizy są fosfatazy białkowe.

Wątroba zawiera glukozo-6-fosfatazę, enzym hydrolityczny, który nie występuje w mięśniach.

Fosfataza uczestniczy w szlaku glikolitycznym. Szybkość przekształcania glukozy do pirogronianu jest regulowana tak, aby zaspokoić główne zapotrzebowania komórki: wytwarzanie ATP kosztem degradacji glukozy i dostarczanie składników budulcowych do syntez, takich jak synteza kwasów tłuszczowych.

W szlakach metabolicznych potencjalnymi miejscami kontroli są enzymy katalizujące reakcje zasadniczo nieodwracalne, tutaj kinezy, których aktywność jest regulowana przez odwracalne wiązanie się czynników allosterycznych lub modyfikację kowalencyjną, a także w wyniku regulacji transkrypcji.

Fruktozo-2,6-bisfosforan jest ważnym regulatorem glikolizy - aktywatorem allosterycznym, który przesuwa równowagę konfirmacyjną tetramerycznego enzymu fosfofruktokinazy ze stanu T do stanu R. Jego stężenie kontrolują 2 enzymy, występujące w jednym łańcuchu polipeptydowym:

- fosfofruktokinaza 2 (PFK2)

- fruktozobisfosfataza 2 (FBPaza 2) - specyficzna fosfataza, przypominająca fosfogliceromutazę. Mutaza jest w zasadzie fosfatazą.

Ten dwufunkcyjny enzym występuje w 5 formach izoenzymatycznych.

Aktywności PFK 2 i FBPazy 2 są odwrotnie regulowane przez fosforyzację pojedynczej reszty seryny. Gdy stężenie glukozy jest małe, wzrost stężenia hormonu glukagonu we krwi wyzwala kaskadę reakcji uruchamianą przez cAMP, prowadzącą do fosforyzacji enzymu dwufunkcyjnego przez kinezę białkową A. Ta kowalencyjna modyfikacja aktywuje FBPazę i hamuje PFK2, zmniejszając stężenie F-2,6-BP. W ten sposób wątroba ogranicza metabolizm glukozy. W sytuacji odwrotnej, gdy stężenie glukozy jest duże, enzym traci przyłączoną wcześniej grupę fosforanową, co aktywuje PFK2 i hamuje FBPazę.

Mechanizm katalizy przez fruktozo-2,6-bisfosfatazę hydrolitycznego odłączenia reszty fosforanowej z węgla 2 fruktozo-2,6-bisfosforanu: udział 7 aminokwasów miejsca katalitycznego; podobnie jak w przypadku proteaz serynowych szczególną rolę odgrywa „triada katalityczna”: 2 reszt His i reszty Glu. Dodatnio naładowane reszty Arg i Lys stabilizują natomiast ujemnie naładowany substrat.

Główna funkcja wątroby polega na utrzymywaniu prawie stałego poziomu glukozy we krwi. Glukoza jest pobierana przez mózg i mięśnie szkieletowe. Ufosforylowana glukoza powstająca wyniku rozkładu glikogenu nie jest łatwo transportowana na zewnątrz komórki. Wątroba zawiera enzym hydrolityczny glukozo-6-fosfatazę, który odłącza grupę fosforanową i uwalnia glukozę oraz ortofosforan. Enzym ten znajduje się w błonie gładkiego retikulum endoplazmatycznego, od strony światła pęcherzyków; jest to ten sam enzym, który uwalnia glukozę pod koniec glukoneogenezy.

Glukozo-6-fosforan jest transportowany do retikulum endoplazmatycznego, wytworzone podczas hydrolizy glukoza i ortofosforan są następnie wahadłowo przenoszone do cytozolu.

Glukozo-6-fosfataza nie występuje w większości tkanek. Powoduje to, że w większości komórek glukozo-6-fosforan służy do wytworzenia ATP. W hepatocytach natomiast glukoza nie stanowi głównego paliwa komórkowego.

Rozkład i syntezę glikogenu wspólnie reguluje kaskada cAMP, uruchamiana przez hormony i działająca przez kinezę białkową Oprócz fosforyzacji i aktywacji kinezy fosforylazowej, kineza białkowa A przyłącza grupę fosforanową do syntezy glikogenowej, co prowadzi dozmniejszenia aktywności tego enzymu. Ten ważny mechanizm kontrolny zapobiega syntezie glikogenu,w czasie gdy zachodzi jego rozkład.

Zmiany aktywności enzymów zachodzące pod wpływem kinaz białkowych odwracają fosfatazy białkowe.

Katalizują one hydrolizę fosforyzowanych reszt seryny i treoniny w białkach. Jeden z tych enzymów, nazwany fosfatazą białkową 1 (PP1) odgrywa kluczową rolę w metabolizmie glikogenu. PP1 inaktywuje kinezę fosforylazową i fosforylazę α przez defosforylację. PP1 zmniejsza szybkość rozkładu glikogenu, ponieważ odwraca efekt kaskady fosforyzacji. Ponadto PP1 usuwa również grupę fosforanową z syntezy glikogenowej bi przekształca ją w znacznie bardziej aktywną formę α. Dlatego PP1 przyspiesza syntezę glikogenu.

Cały kompleks PP1 składa się z 3 części:

- samej PP1, która stanowi podjednostkę katalityczną (37 kDa)

- podjednostki R_G1 (123 kDa) która decyduje o dużym powinowactwie do glikogenu

- małej podjednostki regulacyjnej, inhibitora 1,który w stanie ufosforylowanym hamuje PP1.

Regulacja aktywności PP1: gdy przeważa degradacja glikogenu, aktywna jest PKA. Dwa składniki PP1 są same substratami dla kinezy białkowej A. Fosforyzacja podjednostki R_G1 przez kinezę białkową A zapobiega jej łączeniu się z podjednostką katalityczną PP1. Wskutek tego aktywacja kaskady cAMP prowadzi do inaktywacji PP1, ponieważ nie może ona dłużej wiązać substratu. Fosforyzacja inhibitora 1 przez kinezę białkową A blokuje katalizę przeprowadzanąPP1.

Insulina stymuluje syntezę glikogenu poprzez aktywację fosfatazy białkowej 1. Gdy stężenie glukozy we krwi jest duże, insulina stymuluje syntezę glikogenu uruchamiając szlak, który aktywuje fosfatazę białkową 1.

Metabolizm kwasów tłuszczowych - regulacja ogólnoustrojowa polega na odwracalnej fosforyzacji. Karboksylaza acetylo-CoA jest wyłączana przez fosforyzację i aktywowana przez defosforylację. Modyfikacja pojedynczej reszty seryny przez kinezę białkową zależną od AMP przekształca karboksylazę w formę nieaktywną. Reszta fosforanowa zablokowanej karboksylazy jest usuwana przez fosfatazę białkową 2A. To, jaka część karboksylazy występuje w formie aktywnej, czyli defosforylowanej, zależy od wzajemnego stosunku tych dwóch antagonistycznych enzymów.

Inhibicja fosfatazy 2A jest niezbędna do utrzymania karboksylazy acetylo-CoA w stanie ufosforylowanym. Adrenalina i glukagon aktywują kinazę białkową A, która z kolei inaktywuje fosfatazę, fosforyzując ją.

Fosfataza jest też jednym z enzymów soku jelitowego, wydzielanego przez gruczoły dwunastnicze Brunnera i jelitowe Lieberkuhna. Usuwa resztę fosforanową z organ9cznych związków fosforanowych, np. heksozofosforanów, glicerofosforanów i nukleotydów powstałych powstałych wyniku trawienia kwasów nukleinowych zawartych w pokarmach przez nukleazy, optymalne warunki: pH 8,6.

W badaniach techniką rekombinacji DNA stosowana jest fosfataza alkaliczna, która defosforyluje końce 5' DNA i RNA.

Pod wpływem insuliny - wzrost aktywności fosfatazy fosfoproteinowej 1G (cząsteczka sygnalizacyjna) i spadek aktywności fruktozo-2,6-bisfosfatazy.

Fosfataza zasadowa żołci

Fosfataza kwaśna gruczołu krokowego

Regulacja reakcji defosforylacji białka - fosfatazy fosfoprotein. W mięśniach szkieletowych są 2 głowne typy fosfatazfosfoseryno-fosfotreoninowych. Typ I preferencyjnie defosforyluje podjednostkę ß kinezy fosforylazowej, typ II podjednostkę α. Typ I uczestniczy w regulacji syntezy glikogenowej, fosforylazy i kinezy fosforylazowej. Sama fosfataza jest regulowana drogą fosforyzacji pewnych jej podjednostek; reakcje te ulegają odwracaniu pod wpływem działania jednej z fosfataz typu II. Ponadto 2 ciepłooporne inhibitory białkowe regulują aktywność fosfatazy typu I.

BIOCHEMIA III

CECHY KODU GENETYCZNEGO

Kod genetyczny jest:

1. zdegenerowany

liczne kodony muszą odpowiadać temu samemu aminokwasowi; niektóre aminokwasy są kodowane przez kilka różnych kodonów np. syrenę 6. Metionina i tryptofan mają pojedynczy kodon. Na ogół trzeci nukleotyd kodonu jest mniej ważny niż pozostałe 2 w określeniu swoistego aminokwasu, jaki musi być wbudowany do białka i zjawisko to odpowiada głównie za degenerację kodu. 3 kodony nie kodują swoistego aminokwasu (kodony nonsensowne); przynajmniej 2 z nich są używane w komórce jako sygnały terminacji, określające gdzie należy zatrzymać polimeryzację aminokwasów w cząsteczce białkowej. Pozostałych 61 kodonów koduje 20 aminokwasów.

Gdyby kod genetyczny nie był zdegenerowany, 20 kodonów określałoby aminokwasy, a 44 powodowałyby terminację łańcucha. Prawdopodobieństwo mutacji terminacyjnej powodującej powstanie nieaktywnego białka byłoby dużo większe.

2. jednoznaczny

dany swoisty kodon jest przypisany do pojedynczego aminokwasu (z rzadkimi wyjątkami)

3. nienakładający się

odczytywanie kodu genetycznego w trakcie procesu syntezy białek nie obejmuje żadnych nakładających się kodonów

4. bez znaków przestankowych

nie ma znaków przestankowych między kodonami i przekaz informacji jest odczytywany z ciągłej sekwencji tripletów nukleotydowych, aż do czsu osiągnięcia kodonu nonsensownego

5. uniwersalny

poza jednym wyjątkiem: grupa cząsteczek tRNA w mitochondriach (zawierających oddzielny i różniący się od cytoplazmatycznego mechanizm translacyjny) u niższych niższych wyższych eukariontów z człowiekiem włącznie odczytuje 4 kodony w sposób inny niż cząsteczki tRNA w cytoplazmie nawet tych samych komórek Kodon AUA jest odczytywany jako Met, a UGA koduje Trp w mitochondriach u ssaków. Kodony AGA i AGG są odczytywane w mitochondriach ssaków raczej jako kodony stop kończące łańcuch niż kodujące Arg. W wyniku tego mitochondria dla odczytania kodu genetycznego potrzebują tylko 22 różnych cząsteczek tRNA, podczas gdy cytoplazmatyczny system translacji ma pełny zestaw 31 rodzajów tRNA.

SYNTAZA ATP - BUDOWA, FUNKCJE, INHIBITORY

Syntaza ATP uczestniczy synteza końcowej fazie fosforyzacji oksydacyjnej - syntetyzuje ATP pod naciskiem protonów przepływających z powrotem do matriks mitochondrialnej.

Błonowa syntaza ATP (syntaza ATP, transportująca H⁺ ) wytwarza ATP w obecności ADP i P_i, zużywając różnicę potencjału elektrochemicznego, wynikającą z asymetrycznego rozmieszczenia jonów wodorowych (teoria chemiosmotyczna sprzężenia utleniania z fosforyzacją: energia z procesów utleniania przenośników w łańcuchu oddechowym prowadzi do gromadzenia jonów wodorowych, które są wyrzucane na zewnątrz sprzęgającej błony mitochondrialnej, tzn. błony wewnętrznej). Nie ma bogatoenergetycznego pośrednika wspólnego dla utleniania i fosforyzacji,jak to sugerowano w hipotezie sprzężenia chemicznego.

Powierzchnię mitochondrialnej błony wewnętrznej pokrywają „jednostki fosforyzujące” odpowiedzialne za syntezę ATP. Każda z nich składa się z wielu różnych białek. Hydrofilowy kompleks tych białek wystający z błony w kierunku macierzy określa się mianem F₁ (czynnik sprzęgający 1; jest on złożony z wielu podjednostek (5 rodzajów łańcuchów polipeptydowych) i wykazuje aktywność syntazy ATP. F₁ - główka buławki o średnicy 8,5 nm, charakteryzująca się aktywnością katalityczną kinezy, jest połączona przez tzw. szyjkę z błonowym hydrofobowym kompleksem białkowym F₀ (czynnik sprzęgający wiążący oligomycynę), który prawdopodobnie zajmuje całą grubość błony i jest również zbudowany z wielu podjednostek Protony, przechodząc przez kompleks F₀F₁ warunkują syntezę ATP z ADP i P_{i .}

Podjednostki α i ß tworzące główkę F1 są ułożone naprzemiennie w 6-członowy pierścień, są one względem siebie homologiczne i należą do rodziny NTPaz typu P. Obie wiążą nukleotydy, ale tylko ß uczestniczy bezpośrednio w katalizie. Położony centralnie trzonek zawiera 2 białka: γ i ε. Podjednostka F0 zaiwra kanał protonowy kompleksu, składa się z pierścienia utworzonego z podjednostek podjednostek zanurzonych w błonie i i 1 podjednostki a przylegającą do strony zewnętrznej pierścienia. F0 i F1 są więc polączone przez centralnie położony trzonek i kolumnę zewnętrzną.

Mechanizm sprzężenia przemieszczania protonów z kompleksem syntazy ATP nie jest całkowicie wyjaśniony. Dane doświadczalne wskazują, że bezpośrednia reakcja syntezy ATP nie jest głównym etapem wymagającym dostarczenia energii - jest nim raczej etap uwalniania produktu reakcji (ATP) z centrum katalitycznego syntazy. Niewykluczone, że wymaga on konformacyjnych zmian cząsteczki F₁ wymuszanych przez gradient protonów.

Dokładniej - Stryer18.4. str. 509-514

Syntaza ATP - duży kompleks enzymatyczny zanurzony w błonie kształtem przypominający buławkę, będący motorem molekularnym składa się z 2 funkcjonalnych elementów: wirnika obejmującego pierścień podjednostek c i trzonek i części nieruchomej (stojan). Ruch obrotowy podjednostki γ indukuje zmiany strukturalne w podjednostce ß co umożliwia syntezę, a następnie oderwania cząsteczki ATP od enzymu. Ruch obrotowy jest napędzany przez przepływ protonów ze strony matriksowej na stronę cytozolową wewnętrznej błony mitochondrialnej. Wytworzona siła protonomotoryczna składa się z gradientu pH (1,4) (strona matriksowa jest zasadowa) i potencjału błonowego (0,14 V) (strona matriksowa ma ładunek ujemny). Powrotny przepływ protonów przez syntezę ATP do matriks stanowi siłę napędową syntezy ATP.

Łańcuch oddechowy i syntaza ATP są biochemicznie oddzielnymi układami, związanymi jedynie przez siłę protonomotoryczną.

Syntaza ATP katalizuje syntezę ATP z ADP i ortofosforanu; mechanizm: jeden z atomów tlenu cząsteczki ADP atakuje atom fosforuPi, co prowadzi do utworzenia produktu pośredniego z 5 podstawnikami kowalencyjnymi, z którego następnie przez odłączenie cząsteczki H2) powstaje ATP.

Inhibitory?

Regulacja szybkości fosforyzacji oksydacyjnej przez poziom ADP to kontrola oddechowa.

Proces fosforyzacji oksydacyjnej można hamować na wszystkich etapach;

Przepływ protonów przez syntazę ATP uniemożliwiają oligomycyna i dicykloheksylokarbodiimid (DCCD) - hamują jej aktywność.

Dodanie 2,4-dinitrofenolu i niektórych innych kwasowych związków aromatycznych powoduje rozprzężenie transportu elektronów z fosforyzacją - elektrony są prawidłowo przenoszone z NADH do )2, jednak że mitochondrialna syntaza ATP nie syntetyzuje ATP, bo siła protonomotoryczna wytwarzana w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej ulega rozproszeniu

METABOLIZM KWASU GLUTAMINOWEGO

(wypisałem też przemiany, w których można się z nim spotkać)

Pierwszym etapem degradacji aminokwasów, zbędnych jako elementy budulcowe, jest usunięcie azotu, u ssaków w wątrobie. Grupa aminowa zastaje usunięta, gdyż związki zawirające azot nie biorą udziału w szlakach przekazywania energii. Łańcuch węglowy α-ketokwasów powstających powstających wyniku deaminacji aminokwasów włączany jest do metabolizmu jako prekursor glukozy lub intermedia cyklu kwasu cytrynowego.

Reakcje w których nastepuje przenoszenie grup aminowych między aminokwasami i ketokwasami są klasycznym przykładem mechanizmu podwójnego przeniesienia (ping-pong) czyli istnieje pośrednia forma enzymu z podstawioną grupą, w której enzym jest czasowo zmodyfikowany.

Asparaginian + α-ketoglutaran ↔ glutaminian + szczawiooctan;

enzym aminotransferaza asparaginianowa

Po związaniu asparaginianu enzym usuwa grupę aminową z asparaginianu i wiąże ją tworząc formę pośrednią. Następnie uwalnia się 1-szy produkt: szczawiooctan. Drugi substrat α-ketoglutaran wiąże się do zmodyfikowanego enzymu i przejmuje od niego grupę aminową (dzięki czemu możliwe jest dalsze przekształcenie jej w NH₄⁺), a następnie zostaje uwolniony jako ostateczny produkt reakcji: glutaminian.

Jeden z produktów: szczawiooctan jest uwalniany przed związaniem wszystkich substratów przez enzym.

Grupa α-aminowa wielu aminokwasów jest przenoszona na α-ketoglutaran (enzym transaminaza) i powstaje glutaminian którego deaminacja oksydacyjna prowadzi do odszczepienia jonu amonowego, reakcję katalizuje dehydrogenaza glutaminianowa, który (przynajmniej w niektórych gatunkach) ma rzadko spotykaną zdolność wykorzystywania zarówno NAD⁺ jak i NADP⁺ Reakcja polega na odwodorowaniu wiązania C-N, po czym następuje hydroliza powstającej zasady Schiffa. Równowaga jest przesunięta w kierunku glutaminianu; kierunek ten wymusza zużywanie amoniaku. Dehydrogenaza glutaminianowa, podobnie jak niektóre enzymy biorące udział w syntezie mocznika znajduje się w mitochondriach. Ta kompartmentacja pozwala szybko usuwać wolny amoniak, który jest dla komórki toksyczny.

U kręgowców aktywność dehydrogenazy glutaminianowej jest regulowana allosterycznie. Enzym ten jest zbudowany z 6 identycznych podjednostek. Jego inhibitorami allosterycznymi są trifosforany guanozyny i adenozyny, natomiast ich difosforany są allosterycznymi aktywatorami. Stąd zmniejszenie potencjału energetycznego komórki prowadzi do przyspieszenia oksydacji aminokwasów.

Suma reakcji katalizowanych przez aminotransferazy i dehydrogenazę glutaminianową:

α -aminokwas + NAD⁺ (lub NADP⁺ ) ↔ α-ketokwas + NH₄⁺ + NADH (lub NADPH) + H⁺

U większości kręgowców lądowych NH₄⁺ jest przekształcany w mocznik, który następnie jest wydalany.

Reakcja Stryer str. 640

Wszystkie aminotransferazy zawierają grupę prostetyczną w postaci fosforanu pirydoksalu (PLP), który jest pochodną pirydoksyny (wit. B₆). PLP jest katalizatorem elektrofilowym.

Jego najważniejszą grupą funkcyjną jest grupa aldehydowa, która umożliwia tworzenie produktu pośredniego o charakterze zasady Schiffa pomiędzy PLP i substratami aminokwasowymi. Grupa α-aminowa substratu aminokwasowego zastępuje grupę ε-aminową reszty lizany znajdującej się w centrum aktywnym. Aldoimina wewn ętrzna zostaje zastąpiona aldoiminą zewnętrzną - zasadą Schiffa. Traci ona proton z atomu węgla α aminokwasu w wyniku czego powstaje produkt pośredni: chinoid. Ponowna protonacja daje ketoiminę, która jest następnie hydrolizowana do α-ketokwasu i fosforanu pirydoksaminy (PMP). Drugi α-ketokwas reaguje z kompleksem enzym-fosforan pirydoksaminy i powstaje drugi aminokwas i zregenerowany kompleks enzym-PLP.

Suma tych 2 reakcji częściowych: aminokwas₁ + α-ketokwas₂ ↔ α-ketokwas₁ + aminokwas₂

Alanina + α-ketoglutaran ↔ glutaminian + pirogronian

Reakcje transaminacji są odwracalne i mogą zostać użyte do syntezy aminokwasów z α-ketokwasów.

Degradacja większości aminokwasów odbywa się w tkankach innych niż wątroba, np. mięśnie zużywają aminokwasy jako paliwo komórkowe w czasie przedłużających się ćwiczeń czy głodu.. Mięśnie nie mają enzymów cyklu mocznikowego, zatem uwolniony azot musi mieć odpowiednią formę umożliwiającą jego wchłonięcie przez wątrobę i dalsze przekształcenie w mocznik. Są 2 takie formy:

1) w wyniku reakcji transaminacji tworzy się glutaminian, a następnie azot jest przenoszony na pirogronian, w wyniku czego powstaje alanina, która zostaje uwolniona do krwi, jest wychwytywana przez wątrobę i przekształcana z powrotem w pirogronian przez transaminację. Pirogronian może być wykorzystany w glukoneogenezie, a grupa aminowa ulega przekształceniu w mocznik. Jest to cykl alaninowy.

2) azot może być również transportowany jako glutamina powstająca w reakcji zależnej od ATP:

NH4 + glutaminian + ATP → glutamina + ADP + P_i

W wątrobie azot zawarty w glutaminie może zostać przekształcony w mocznik.

Cykl mocznikowy

Kręgowce i bezkręgowce wodne uwalniają azot w postaci NH4+, wykorzystując środowisko wodne do rozcieńczania; ptaki - w postaci kwasu moczowego.

Atomy węgla pochodzące z degradowanych aminokwasów pojawiają się w głównych intermediatach metabolicznych, które mogą być przetwarzane w glukozę lub utleniane w cyklu kwasu cytrynowego.

Łańcuchy węglowe aminokwasów 5-węglowych wchodzą do cyklu kwasu cytrynowego cytrynowego postaci α-ketoglutaranu. Aminokwasy te: glutamina, pralina, arginina, histydyna są najpierw przekształcane w glutaminian, który ulega następnie oksydacyjnej deaminacji do α-ketoglutaranu; reakcję katalizuje dehydrogenaza glutaminianowa

Histydyna ulega przekształceniu w 4-imidazolono-5-propionian; hydroliza wiązania amidowego w pierścieniu prowadzi do powstania N-formiminowej pochodnej glutaminianu, która jest przekształcana w glutaminia w wyniku przeniesienia grupy formiminowej na tetrahydrofolian, nośnik aktywowanych jednostek jednowęglowych.

Glutamina jest hydrolizowana przez glutaminazę do glutaminianu i NH4+.

Prolina i arginina ulegają przekształceniu w γ-semialdehyd glutaminianowy, następnie utleniany do glutaminianu.

Reakcje Stryer str 651

Reakcje transaminacji są odwracalne i mogą zostać użyte do syntezy aminokwasów z α-ketokwasów

Glutaminian jest prekursorem glutaminy, proliny i argininy, aminokwasów endogennych.

Grupa γ-karboksylowa glutaminianu reaguje z ATP tworząc acylofosforan. Jest to mieszany bezwodnik który ulega redukcji z udziałem NADPH do aldehydu.

γ-semialdehyd glutaminianu ulega cyklizacji tracąc cząsteczkę wody i dając kwas prolino-5-karboksylowy (bez udziału enzymu), następnie redukcja z udziałem NADPH i powstaje pralina. Semialdehyd może ulegać także transaminacji tworząc ornitynę, która zostaje przekształcona w argininę. Str. 673-674

Glutaminian i glutamina pełnią zasadniczą rolę w procesie wbudowywania NH₄⁺ do aminokwasów

Glutaminian jest syntetyzowany z NH₄⁺ i alfa-keto glutaranu, intermediatu cyklu kwasu cytrynowego cytrynowego reakcji prowadzonej przez dehydrogenazę glutaminianową, poprzez zasadę Schiffa. Stryer str 669-670

---