Laboratorium specjalizacyjne

Sprawozdanie 1

Metody kontroli stanu higienicznego powierzchni

Ewa Świegocka

Biotechnologia

Sem. VI

Nr Indeksu 183884

1. Wstęp

Istotnym wskaźnikiem czystości urządzeń jest stopień zanieczyszczenia mikrobiologicznego powierzchni używanych w przemyśle i poza nim. Drobnoustroje obecne na powierzchni maszyn, rąk oraz ubrań osób uczestniczących w procesie produkcji mogą stanowić często źródło zanieczyszczeń surowców, oraz wyrobów gotowych. Ocena zanieczyszczenia powierzchni obejmuje głównie kontrolę obecności Escherichia coli, a także Salmonella sp., Staphylococcus aureus i Listeria monocytogenes [Kręgiel D., 2012].

W krajach Unii Europejskiej obowiązują ważne przepisy nazywane pakietem higienicznym. Zawiera on rozporządzenia dotyczące zasad higieny środków spożywczych (nr 852/2004 „Higiena środków spożywczych”, nr 853/2004 „Higiena środków spożywczych pochodzenia zwierzęcego”) a także zasad postępowania urzędowych kontroli (nr 882/2004 „Kontrola urzędowa żywności”, nr 854/2004 „Kontrola higieny środków spożywczych pochodzenia zwierzęcego”). Z związku z tymi regulacjami związane jest Rozporządzenie WE 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. „w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych” wraz z nowelizacjami (WE 1441/2007, WE 365/2010 oraz WE 1086/2011). Rozporządzenie WE 2073/2005 wprowadza m.in. pojęcie kryterium mikrobiologicznego, które odnosi się zarówno do bezpieczeństwa żywności, jak i także do istotnej higieny procesu jej wytwarzania. Przedsiębiorstwa należące do sektora spożywczego powinny samodzielnie decydować o częstotliwości pobierania oraz badania próbek według obowiązujących je procedur opartych na zasadach nazywanych HACCP. Wyniki badań zależą od metody analitycznej, która została zastosowana, więc do każdego kryterium mikrobiologicznego powinna być przyporządkowana odpowiednia metoda referencyjna. Rozporządzenie WE 2073/2005 zaleca stosowanie normy horyzontalnej ISO 18593 opisującej, jako metody referencyjne metody pobierania próbek z powierzchni, metodę płytek kontaktowych i metodę wymazów.

Metoda wymazów

  Stosowana do oceny zanieczyszczenia mikroorganizmami płaskich lub wypukłych powierzchni, tj. kadzie fermentacyjne, beczki, zawory, uszczelki, a także do oceny czystości mikrobiologicznej rąk pracowników. W celu pobrania próby wykonuje się wymaz z badanej powierzchni wymazówką, tamponem z waty, gazy lub gąbki. Do pobierania próbek z powierzchni płaskich lub słabo wygiętych stosuje się szablon w kształcie ramki o znanej powierzchni, zwykle 25 lub 100 cm₂. Pobraną próbę przenosi się do jałowego płynu do wymazów (zbuforowana woda peptonowa lub płyn fizjologiczny z peptonem) i dokładnie wytrząsa w celu zawieszenia drobnoustrojów w roztworze. W przypadkach, gdy badana powierzchnia została poddana wcześniej procesom mycia i dezynfekcji, stosuje się neutralizatory, które zapobiegają toksycznemu działaniu środków dezynfekcyjnych na mikroorganizmy. Zawiesiny po wymazach powinny zostać poddane badaniom mikrobiologicznym w ciągu 24 godzin od pobrania, poprzez posiewy na płytki z kompleksową/selektywną pożywką agarową/płynną, w zależności od rodzaju oznaczanej mikroflory. 

Metoda płytek kontaktowych

  Stosowana jest do oznaczania stopnia mikrobiologicznego zanieczyszczenia gładkich, płaskich powierzchni produkcyjnych, folii opakowaniowych, pergaminów, wieczek, korków i innych drobnych przedmiotów. Powierzchnię płytki należy przycisnąć do badanej powierzchni na około 5-10 s, nie wykonując przy tym żadnych ruchów bocznych. Bezpośrednio po pobraniu próbki płytki kontaktowe należy szczelnie zamknąć. Do badania ogólnej liczby drobnoustrojów należy zastosować płytkę odciskową z podłożem TSA lub PCA, agar VRBG dla bakterii z rodzaju Enterobacteriaceae czy podłoże Sabourauda z chloramfenikolem dla drożdży i pleśni. Jeżeli podejrzewamy, że na badanej powierzchni mogą pozostać resztki środków myjących, należy stosować wyżej wymienione podłoża z dodatkiem neutralizatora. Płytki należy inkubować zgodnie z instrukcją producenta w odpowiedniej dla badanych drobnoustrojów temperaturze.

Do metod alternatywnych zaliczamy między innymi metodę luminometryczną, testy białkowe oraz testy enzymatyczne.

Metoda luminometrii

Polega na oznaczaniu stężenia ATP (adenozynotrifosforanu). Obecność ATP w próbkach pobranych do oceny stanu czystości w zakładzie wskazuje na istnienie różnych zanieczyszczeń organicznych (pozostałości roślinne, zwierzęce oraz mikroorganizmy). W reakcji luminescencji specyficzny substrat - lucyferyna ulega utlenieniu w wyniku reakcji katalizowanej przez oksydazę zwaną lucyferazą. W wyniku oksydacji powstaje utleniona forma lucyferyny - oksylucyferyna, którą charakteryzuje podwyższony stan energetyczny. Stan ten jest jednak nietrwały i oksylucyferyna powraca do niższego stanu energetycznego, emitując energię w postaci światła. Wielkość emisji światła mierzona jest za pomocą luminometru, a wynik podawany jest w postaci umownych jednostek świetlnych RLU (ang. Relative Light Unit).Do oceny wyznaczonych punktów pomiarowych metodą luminometrii otrzymane wyniki porównuje się z wartościami progowymi, wyznaczonymi dla danej branży, danego zakładu i poszczególnych miejsc pomiarowych. Niski poziom RLU wskazuje, że punkt pomiarowy jest czysty, wolny od zanieczyszczeń organicznych i mikrobiologicznych, natomiast gdy poziom RLU jest wysoki, to punkt należy uznać jako zanieczyszczony substancjami organicznymi. Dla każdej powierzchni należy ustalić tzw. „tło oznaczenia”, czyli taki poziom RLU, który wynika z rodzaju surowca, rodzaju powierzchni oraz materiału, z jakiego została wykonana. Wartości tła oraz poziom tzw. ustala się dla czystej powierzchni.

Testy białkowe

  Służa do wykrywania zarówno białek, jak i aminokwasów mają zastosowanie w branżach, gdzie surowiec/produkt jest bogaty w tego rodzaju związki (przemysł mięsny, drobiarski, rybny, mleczarski). Istnieje kilka różnych testów komercyjnych dla oznaczania substancji białkowych, np. Orion Clean Card® PRO, Hygicult® On, które umożliwiają wykrycie zanieczyszczeń w czasie 1-10 minut od pobrania próbki, w zależności od poziomu zanieczyszczenia.

Testy enzymatyczne

Pozwalają na wykrycie specyficznych enzymów, a tym samym na detekcję określonych grup drobnoustrojów. Przykładem może być HY-RiSE® - prosty test jakościowy, który opiera się na oznaczaniu dinukletydu nikotynoadeninowego (NAD, NADH) lub fosforanu dinukletydu nikotynoadeninowego (NADP, NADPH) w reakcji enzymatycznej, której efektem jest powstanie zabarwienia na strefie reakcyjnej paska. Intensywność barwy jest wprost proporcjonalna do ilości badanych związków na powierzchni roboczej, narzędziach, klamkach oraz rękach pracowników. Dzięki wynikowi otrzymanemu już po 4-5 minutach można bardzo szybko ocenić stan zanieczyszczenia powierzchni oraz podjąć natychmiast działania eliminujące nieprawidłowości.

2. Materiały i metody

1. Materiały

Materiał badawczy stanowiły powierzchnie laboratorium Mikrobiologii Technicznej w Instytucie Mikrobiologii Technicznej i Fermenatacji na Wydziale Biotechnologii i Nauk o Żywności Biotechnologii Politechniki Łódzkiej.

2. Stosowane pożywki

W przeprowadzonych analizach zastosowano pożywki PCA i TSA do określenia ogólnej liczby drobnoustrojów oraz VRBD do oznaczenia liczby bakterii z rodziny Enterobacteriaceae.

3. Metody badawcze

1. Metody referencyjne badania czystości powierzchni

Metoda wymazów

Jałowy szablon o powierzchni
przyłożono do badanej powierzchni. Wymazówkę włożono do kolbki zawierającej 20 ml jałowego płynu do wymazów, następnie wilgotną wymazówką wytarto powierzchnię ograniczoną szablonem. Pobrana próba została przeniesiona do jałowego roztworu i dokładnie wytrząsana w celu zawieszenia drobnoustrojów w roztworze. Badana powierzchnia została osuszona drugą sterylną wymazówką, którą również przeniesiono do kolbki z jałowym roztworem i wypłukano lekko wstrząsając. Z zawiesiny po wymazach zostały wykonane cztery wysiewy dla każdej badanej powierzchni. W tym celu pobrano po 1 ml na dwie płytki Petriego i dokonano posiewu wgłębnego z zastosowaniem odżywczego podłoża bulionowego PCA oraz pobrano po 1 ml na dwie płytki Petriego i wykonano posiew wgłębny z zastosowaniem odżywczego podłoża bulionowego VRBD. Wysiane próby poddane zostały inkubacji w warunkach odpowiednich dla oznaczanej grupy drobnoustrojów. Następnie policzono kolonie wyrosłe na płytkach Petriego i uwzględniając początkową objętość płynu do wymazów oraz pole powierzchni ograniczonej szablonem obliczono ogólną liczbę drobnoustrojów na powierzchnię 100
oraz liczbę bakterii z rodziny Enterobacteriaceae przypadającą na powierzchnię 25
.

Metoda płytek kontaktowych

Płytki oraz testy odciskowe po otworzeniu zostały dociśnięte do badanych powierzchni i przytrzymane przez 5-10 sekund. Następnie zostały zamknięte, wstawione do termostatu i inkubowane w warunkach odpowiednich dla oznaczanej grupy drobnoustrojów. Po inkubacji, wyrosłe kolonie policzono i uwzględniając powierzchnie płytek i testów odciskowych podano ogólną liczbę drobnoustrojów na 100
oraz liczbę bakterii z rodziny Enterobacteriaceae występujących na 25
badanej powierzchni.

2. Metody alternatywne

Testy łopatkowe

Z plastikowego pojemnika zakręcanego korkiem wyjęto płytkę pokrytą po obu stronach pożywką, po czym dociśnięto ją do badanej powierzchni. Łopatki po pobraniu próby umieszczono z powrotem do pojemnika i inkubowano w warunkach odpowiednich dla określonej grupy drobnoustrojów. Wyniki zostały opracowane w oparciu o załączone wzorce odczytu, uwzględniając pole powierzchni łopatki obliczono liczbę drobnoustrojów przypadającą na powierzchnię 100
.

Metoda luminometryczna- systemu

W celu oznaczenia stężenia ATP z zastosowaniem luminometru
, zwilżono wymazówkę w roztworze do przemywania i zrobiono wymaz z badanej powierzchni z użyciem szablonu o powierzchni 25
. Następnie wymazówkę wypłukano w roztworze do przemywania i wyrzucono. W naczyniu z roztworem przemywającym zanurzono końcówkę pióra, a następnie uderzono nią w celu wprowadzenia próbki do komory reakcyjnej. Reakcja zaszła w momencie uwolnienia odczynników, po przekręceniu części pióra. Po dokładnym wymieszaniu wprowadzono pióro do luminometru, odczekano ok. 15 sekund i odczytano wynik na cyfrowym wyświetlaczu. Wynik pomiaru wyrażony został w postaci umownych jednostek świetlnych RLU.

Test

Pasek testowy wyjęto z opakowania i pokryto obszar testowy paska substancją zwilżającą. Tak przygotowany pasek został dociśnięty do badanej powierzchni i przesunięty na odległość ok. 30 cm. Na powierzchniach nierównych, próbki zostały zebrane przez dociśnięcie paska testowego do minimum 10 różnych punktów na badanej powierzchni. Po zebraniu próby, na obszar testowy paska naniesiono kroplę roztworu substratu, a następnie kroplę roztworu enzymu. Pasek testowy włożono z powrotem do opakowania i inkubowano 4-5 minut w temperaturze 15-30
. Po czasie inkubacji określono kolor obszaru testowego i porównano ze skalą wzorców dla powierzchni czystej i brudnej.

Surface Protein Plus (Noack)

Po wyjęciu wymazówki z opakowania, dokonano wymazu badanej powierzchni i włożono badaną próbę z powrotem do opakowania. Następnie uwolniono odczynniki reagujące i wymieszano przez kilka sekund. Próbę inkubowano 10 minut w temperaturze pokojowej. Interpretacji wyników dokonano na podstawie załączonej tabeli.

Po wyjęciu testu z pudełka i zwilżeniu badanej powierzchni sterylną wodą, przyłożono test do powierzchni i po 30 sekundach odczytano wynik. Oceny stanu higienicznego dokonano na podstawie zabarwienia testu- im bardziej zielone zabarwienie, tym badana powierzchnia zawiera więcej substancji białkowych.

3. Wyniki

Wyniki badań przedstawiono w tabeli poniżej

Tabela 1 Ogólna liczba drobnoustrojów oznaczona różnymi metodami

Ogólna liczba drobnoustrojów [jtk/100 cm^2]
badana powierzchnia	metoda wymazów	metoda płytek kontaktowych	testy łopatkowe	testy odciskowe
Blat 1	7,20*10^2	1,80*10^2	3,5*10^2	4
Blat górny	2,40*10^2	1,90*10^2	Nie badano	Nie badano
Blat dolny	4,80*10^2	1,40*10^2	Nie badano	Nie badano
Parapet 1	4,00*10^2	1,60*10^2	Nie badano	Nie badano
Blat 2	2,40*10^3	4,40*10^2	3,0*10^2	2,4*10^3
Szafka	2,20*10^3	1,70*10^2	Nieobecne na powierzchni	Nie badano
Zlew	9,60*10^2	4,00*10^2	4,0	1,8*10^3
Drzwi	0	0	6,0	2,9*10^2
Parapet 2	4,80*10^2	2,20*10^2	Nie badano	1,8*10^2
Klamka	8,8*10^2	1,8*10^2	4,0	Nie badano

Na podstawie uzyskanych wyników dla metody wymazów, można zauważyć, że najbardziej zanieczyszczone powierzchnie to blat 2 i szafka. Uwzględniając skalę oceny czystości powierzchni wg Draft European Standard CEN/TC 234/WG 2, stopień ryzyka w przypadku tych wyżej wymienionych powierzchni wynosi 1. Natomiast najczystszą powierzchnię stanowią drzwi. Stopień ryzyka w tym przypadku wynosi 4. Według testu odciskowego, najbardziej zanieczyszczoną powierzchnię stanowi również blat 2. Trudna aplikacja testu odciskowego uniemożliwiła zbadanie niektórych powierzchni. Porównując metodę wymazów z metodą płytek kontaktowych, można stwierdzić, że metoda wymazów jest dokładniejsza. Porównanie metody wymazów i płytek kontatkowych zostało przedstawione na wykresie 1., a na podstawie wykresu 2. wyznaczony został współczynnik korelacji dla tych metod.

Wykres 1. Porównanie metod badań higienicznych

Wykres 2 Obliczanie współczynnika korelacji R

R²=0,3789 więc korelacja wynosi: R=0,6155

Jest to umiarkowana korelacja dodatnia.

Tabela 2. Wyniki uzyskane metodą luminometryczną dla poszczególnych powierzchni

Ogólna liczba drobnoustrojów [jtk/25 ]
Badana powierzchnia	RLU
Blat 1	550
Włącznik	450
Zlew	110
Klamka	370

Na podstawie wyników zamieszczonych w Tabeli 2., nie można jednoznacznie stwierdzić stopnia zanieczyszczenia, gdyż nie zostało wyznaczone tło konieczne do porównania wyników.

Tabela 3. Liczba bakterii rodziny z rodziny Enterobacteriaceae dla poszczególnych powierzchni

Liczba bakterii z rodziny Enterobacteriaceae [jtk/25 ]
Badana powierzchnia	Metoda wymazów	Metoda płytek kontaktowych	Testy odciskowe
Blat 1	<1	<1	<1
Blat górny	<1	<1	<1
Blat dolny	<1	<1	<1
Parapet 1	<1	<1	<1
Blat 2	<1	<1	<1
Szafka	<1	<1	<1
Zlew	<1	<1	<1
Drzwi	<1	<1	<1
Parapet 2	<1	<1	<1
Klamka [jtk/powierzchnię klamki]	<1	<1	<1

4. Wnioski

• Powierzchnia drzwi jest najczystsza ze wszystkich badanych powierzchni w laboratorium mikrobiologicznym.

• Stopień ryzyka według skali ocen czystości powierzchni jest oceniany jako 2.

• Na badanych powierzchniach nie stwierdzono obecności bakterii z rodziny Enterobacteriaceae.

5. Literatura

1. Libudzisz Z., Kowal K. Żakowska Z. (red): Mikrobiologia techniczna. t. II. Mikroorganizmy w biotechnologii, ochronie środowiska i produkcja żywności. PWN, Warszawa, 2008.

2. Kręgiel D., (2012). Higiena produkcji pod kontrolą, „Agro Przemysł”, 1, 62- 66.

3. Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych. Dz. U. UE L 338/1.

4. PN-ISO 18593:2005 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalne metody pobierania próbek z powierzchni z użyciem płytek kontaktowych i wymazów.

5. www.labnews.pl/informacje/Referencyjne-i-alternatywne-metody-kontroli-stanu-higienicznego-powierzchni,112 (dostęp 19.03.2015)

---