Chemia kliniczna - ćwiczenia 5.10.2010

Gospodarka wodno - elektrolitowa i mineralna cz. I

Metody oznaczania elektrolitów. Pomiar osmolalności.

Metody laboratoryjne stosowane w chemii klinicznej :

1. Metody spektroskopowe

2. Metody elektrochemiczne

3. Metody rozdzielcze

4. Metody immunologiczne

Ad. 1 Metody spektroskopowe:

• Spektrofotometria absorpcyjna (VIS, UV, IR) najczęściej stosowana

• 
  Emisyjna fotometria płomieniowa

• Absorpcyjna spektrometria atomowa dla elektrolitów

( in. Spektrometria atomowo - absorpcyjna)

• Fluorymetria

• Turbidymetria i nefelometria

• Refraktometria

• Polarymetria

Ad. 2 Metody elektrochemiczne :

• Potencjometria (elektrody jonoselektywne)

• Metody konduktometryczne

• Metody polarograficzne

Ad. 3 Metody rozdzielcze:

• Wirowanie

• Elektroforeza

• Chromatografia

Ad. 4 Metody immunologiczne:

• Bezpośrednie wykrywanie antygenów i przeciwciał:

• Aglutynacja

• Immunoprecypitacja:

- immunodyfuzja wg Manciniego

- immunodyfuzja wg Ouchterlony' ego

- immunoelektrofreza i immunofiksacja

- immunoturbidymetria

- immunonefelometria

• Pośrednie wykrywanie antygenów i przeciwciał:

• Osadzanie substratów reakcji na cząstkach nośnikowych:

- aglutynacja lateksowa i hemaglutynacja pośrednia

- odczyn wiązania dopełniacza

- bezpośredni odczyn hamowania hemaglutynacji

• Ligandowe metody immunologiczne:

- m. radioimmunologiczne ( RIA)

- m. immunoenzymatyczne ( EIA)

- m. immunofluorescencyjne ( FIA)

- m. immunoluminescencyjne ( LIA)

- m. immunoblotting ( western i eastern blotting)

Metody analityczne stosowane do oznaczania elektrolitów :

1. Potencjometria (elektrody jonoselektywne)

2. Emisyjna fotometria płomieniowa

3. Absorpcyjna spektrometria atomowa

4. Kolorymetria ( rzadko)

Ad. 1 Potencjometria

- z wykorzystaniem odpowiednich elektrod jonoselektywnych

- układ do badań składa się z 2 elementów:

I . para elektrod tworzących z badanym roztworem ogniwo pomiarowe

II. przyrząd pomiarowy pozwalający na pomiar siły elektromotorycznej tego ogniwa

- jedna z elektrod jest elektrodą wskaźnikową, druga natomiast elektrodą porównawczą (odniesienia)

-daną substancje można oznaczyć potencjometrycznie tylko wtedy, gdy istnieje czuła na nią elektroda wskaźnikowa. Do grupy elektrod wskaźnikowych należą elektrody jonoselektywne.

ELEKTRODY JONOSELEKTYWNE:

- elektrody membranowe

- przez dobór odpowiednich związków chemicznych budujących elektromembrany uzyskano elektrody czułe na odpowiednie jony ( kationy i aniony)

Układy do badań potencjometrycznych składają się z 2 zasadniczych części:

- pary elektrod tworzących z badanym roztworem ogniwo pomiarowe,

- przyrządu pomiarowego, przeliczającego na pomiar siły elektromotorycznej tego ogniwa.

Jedna z elektrod jest zwykle elektrodą wskaźnikową a druga elektrodą porównawczą (odniesienia).

- w zależności od stanu skupienia fazy membrany wyróżniamy elektrody jonoselektywne z membranami :

• stałymi

• ciekłymi

• enzymatycznymi

• gazowymi (selektywne elektrody gazowe)

Elektrody stosowane do oznaczania aktywności konkretnych jonów:

1. jony sodu - elektrody szklane wrażliwe na sód

2. jony potasu - elektrody membranowe ciekłe z antybiotykiem walinomycyną

3. jony chlorkowe - elektrody membranowe wysycone AgCl

4. jony wapnia - elektrody membranowe z długołańcuchowym diestrofosforanem

5. jony magnezu - elektrody wrażliwe na magnez

Ad. 2 Emisyjna fotometria płomieniowa (Fotometria płomieniowo-emisyjna)

- zasadą tej metody jest wprowadzenie w stan wzbudzenia atomów pierwiastków przez umieszczenie próbki w płomieniu o określonej temperaturze, co powoduje wzbudzenie,

- wzbudzenie powoduje emisję fotonów dającą widmo charakterystyczne dla danego pierwiastka

- poszczególne pierwiastki różnią się wartością potencjału wzbudzenia, dlatego dla różnych pierwiastków należy stosować różne źródła dostarczające energię np.

• sód, potas -niski potencjał wzbudzenia więc stosujemy mieszankę propan - butan ( ok. 1900 st. C)

• wyższą temperaturę daje spalenie acetylenu z powietrzem ( 2100 -2300 st C), lub acetylenu z tlenem (2800 st. C) dla Ca i Mg

- dobór odpowiedniego filtra barwnego pozwala na wybiórcze oznaczanie stężenia pierwiastków. Najczęściej stosowane filtry barwne:

• sód - 590 lub 630 nm

• potas 770 nm

Ad. 3 Absorpcyjna spektrometria atomowa (Spektometria atomowo-absorpcyjna):

- próbkę umieszczamy w płomieniu palnika -> wzbudzenie atomów pierwiastka, które w konsekwencji pochłaniają światło o charakterystycznej długości fali.

Stopień absorpcji światła jest proporcjonalny do zawartości pierwiastka w próbie.

-jest to metoda referencyjna oznaczania magnezu i wapnia ( dla tych pierwiastków stosujemy palnik acetylenowy, ponieważ mają wyższy potencjał wzbudzenia)

Wymogi idealnej metody analitycznej oznaczania elektrolitów:

1. wysoka swoistość

2. wysoka powtarzalność

3. wysoka dokładność

4. minimalna objętość próbki

5. prostota stosowania

6. szybkie przeprowadzenie analizy ma znaczenie we wskazaniach nagłych

- Metoda kolorymetryczna w znacznym stopniu nie spełnia tych wymagań

- Spektrometria atomowa - absorpcyjna spełnia punkty 1-3 , ale jest droga

- Emisyjna fotometria płomieniowa spełnia punkty 1-5, ale nakład czasu na przygotowanie próbki jest znaczny (nie spełnia pn. 6)

- elektrody jonoselektywne jako jedyne spełniają WSZYSTKIE wymogi idealnej metody oznaczania elektrolitów.

METODY OZNACZANIA SODU I POTASU:

1. Fotometria emisyjno płomieniowa - oznacza całkowite stęż. tych elektrolitów w surowicy

2. Metoda potencjometryczna z wykorzystaniem elektrod jonoselektywnych (najczęściej stosowana) - oznacza aktywność wolnych cząsteczek elektrolitu (jonów) w wodzie surowicy

jony sodu - elektrody szklane wrażliwe na sód

jony potasu - elektrody membranowe ciekłe z antybiotykiem walinomycyną

TYLKO SÓD - m. kolorymetryczna z uranylooctanem magnezu:

- sód wytrącany jest uranylooctanem magnezu, a uwolnione jony uranylu tworzą w zawiesinie żółto- brązowy kompleks z kwasem tioglikanowym

-Różnica pomiędzy absorbancją próby ślepej ( bez wytracania) a absorbancja próby badanej jest proporcjonalna do stężenia sodu w próbie badanej przy λ= 360 - 410 nm

C_Na =

METODY MIARECZKOWE - podział:

1. kompleksometria (metody oparte na tworzeniu się trwałych związków kompleksowych) :

• kompleksonometria ( jako odczynniki miareczkujące stosuje się kompleksony)

• merkurometria ( metody wykorzystujące tworzenie się kompleksowych związków z rtęcią)

KOMPLEKSONY :

- odczynniki organiczne, tworzące z metalami związki chelatowe

- stosowane do oznaczania kationów 2,3,4 wartościowych i innych

- należą tu kwasy aminopolikarbonowe np.

• EDTA ( kw. wersenowy)

• GEDTA (pochodna glikolowa EDTA)

• EGTA (pochodna etylenoglikolowa kwasu tetraoctowego)

2. precypitometria ( metody wytraceniowe)

• Argentometria (metody wykorzystujące tworzenie się trudno rozpuszczalnych związków srebra)

• Kulometria - odmiana argentometrii, w której jony srebra pochodzą z elektrody srebrowej.

3. alkacymetria :

• alkalimetria

• acydymetria

d) redoksymetria

METODY OZNACZANIA JONÓW CHLORKOWYCH:

1. Metoda potencjometryczna ( z wyboru) z wykorzystaniem elektrod jonoselektywnych (analizatory jonoselektywne)

jony chlorkowe - elektrody membranowe wysycone AgCl

2. Metoda enzymatyczna z α-amylazą zależną od chloru ( analizatory biochemiczne)

3. Merkurometria ( miareczkowanie solami rtęci):

• Met. Z rodankiem rtęci i jonami żelaza

• Met. Z azotanem rtęci i difenylokarbazonem

• Met. Z kompleksem rtęci i tripirydylo -S- triazyny ( TPTZ) i jonami żelaza

• Met. Z chloranilem rtęci

Argentometria ( miareczkowanie solami srebra):

• Met. Mohra

• Met. Volharda

• Kulometria ( odmiana argentometrii)

5. metody z kwasem metanosulfonowym

METODY OZNACZANIA WAPNIA:

- metody referencyjne

a) dla wapnia CAŁKOWITEGO - spektrometria atomowo - absorpcyjna

b) dla wapnia ZJONIZOWANEGO - elektroda jonoselektywna (elektroda membranowa z długołańcuchowym diestrofosforanem )

- gdy nie możemy użyć wyżej wymienionych to wykorzystujemy do oznaczania wapnia CAŁKOWITEGO - met. Kompleksometryczne z pomiarem fotometrycznym :

1. met. Z kompleksonem orto-krezoloftaleiny

2. met. Z błękitem metylotymolowym (BMT)

3. met. Z arsenazo III

4. met. z EDTA

5. met. Z GBHA ( glioksalobishydroksyamina)

6. met. Z kwasem chloranilowym

7. met. Manganometryczna

METODY OZNACZANIA MAGNEZU:

- referencyjne :

a) magnez CAŁKOWITY - spektrometria atomowo- absorpcyjna

b) magnez ZJONIZOWANY - elektrody jonoselektywne czułe na magnez

- gdy brak w/w metod to do oznaczania magnezu CAŁKOWITEGO stosowane są metody kompleksometryczne z pomiarem fotometrycznym :

1. met. Z błękitem ksylidowym

2. met z błękitem metylotymolowym

3. met. Z kalmagitem

4. met. Z żółcienią tytanową

5. met z chlorofosfonazo III

METODY OZNACZANIA FOSFORU NIEORGANICZNEGO:

• Metoda Fiska-Subbarowa z molibdenianem amonu (najczęściej)

- jony fosforanowe tworzą z molibdenianem amonu w środowisku kwaśnym i w obecności detergentu bezbarwny fosfomolibdenian amonu. Zmiana absorbancji mierzona przy λ=340 nm jest proporcjonalna do stężenia jonów fosforanowych w próbie.

- często występują modyfikacje tej metody , w których dodatkowo następuje redukcja fosfomolibdenianu do błękitu molibdenowego, który jest związkiem barwnym i dlatego możemy wtedy mierzyć intensywność zabarwienia.

Środki redukujące fosfomolibdenianu do błękitu molibdenowego:

• Kwas askorbowy

• Chlorek cynawy

• Hydrochinon

• inne

METODY OZNACZANIA ŻELAZA:

1. Metoda spektrofotometryczna (kolorymetryczna w świetle widzialnym najczęściej)

2. Absorpcyjna spektrometria atomowa

3. Metoda kulometryczna

Ad.1 Metoda spektrofotometryczna

a) Metoda zalecana przez Międzynarodowy Komitet Standaryzacji w Hematologii

- składa się z 3 etapów ;

I. odbiałczanie surowicy i uwolnienie żelaza z połączeń z białkami (transferryną)

II. redukcja Fe³⁺ -> Fe ²⁺ np. za pomocą FeCl₃

III. połączenie Fe²⁺ z chromogenem ( reakcja barwna)

b) Metoda Ramsaya ( z odbiałczaniem)

- I etapowa -odbiałczanie surowicy, redukcja żelaza i połączenie z chromogenem zachodzi jednocześnie

c) Metoda bezpośrednia ( BEZ odbiałczania)

- dodanie chromogenu ze związkami redukującymi żelazo do surowicy nieodbiałczonej

CHROMOGENY:

• Batofenantrolina

• Chromazurol

• TPTZ ( tripirydylo-S-triazyna)

• Ferrozyna

• Fenantrolina

OZNACZANIE całkowitej zdolności wiązania żelaza ( TIBC )

1. wysycenie transferyny obecnej w surowicy jonami Fe ³⁺ (FeCl₃)

2. zaadsorbowanie nadmiaru Fe ( np. z użyciem Al₂O₃ lub MgCO₃)

3. oznaczenie Fe ( metoda kolorymetryczna)

METODY OZNACZANIA CYNKU:

- metoda kolorymetryczna z fosfosiarczanem adenozyny ( 5 Br- PAPS)

- zasada:

Cynk w środow. Zasadowym ( pH= 8,6) tworzy z zw. kompleksującym (fosfosiarczanem adenozyny) stabilny pomarańczowy kompleks. Intensywność zabarwienia przy λ=560 nm jest proporcjonalna do stężenia cynku z badanej próbie.

OSMOLALNOŚĆ

Definicja: liczba moli substancji osmotycznie czynnej zawartej w 1 kg czystego rozpuszczalnika (wody)

Jednostka: osmol-ciśnienie osmotyczne jakie wywiera jedno molalny roztwór związku niedysocjujacego w temperaturze 0 stopni C.

Metody pomiaru:

1. bezpośrednia - pomiar za pomocą osmometru

2. szacunkowa- wartość obliczona ze wzoru

Ad.1 bezpośrednia

-metoda krioskopowa ( za pomocą osmometru)

- zasada metody - podstawowe prawo kriometrii:

Obniżenie temperatury krzepnięcia roztworu względem temperatury krzepnięcia czystego rozpuszczalnika ( wody) jest proporcjonalne do osmolalności roztworu.

-przebieg pomiaru:

Podczas pomiaru próbka roztworu badanego podlega ciągłemu schładzaniu. Z chwila osiągnięcia wymaganej temperatury przechłodzenia, w próbce zachodzi krystalizacja, a w jej wyniku powstaje dwufazowy układ (roztwór- kryształki lodu). Temperatura układu wzrasta do wartości maksymalnej zależnej od osmolalności roztworu, temperatury inicjacji krystalizacji, mocy chłodzenia, przewodności i pojemności cieplnych roztworu ciekłego i wymrożonego oraz schłodzenia głowicy pomiarowej z naczynkiem.

EFEKTYWNA MOLALNOŚĆ (Tonia) - molalność osocza uwarunkowana obecnością substancji nieprzenikających przez błony komórkowe ( Na, Cl, wodorowęglany, glukoza). Efektywna molalność warunkuje ruch wody między przestrzeniami.

Regulacja osmolalności :

• na poziomie nerek ( wazopresyna)

• ośrodek pragnienia

Wartości prawidłowe osmolalności surowicy : 275 - 295 mmol/ kg H₂O

Przyczyny hipoosmii :

1. obniżona zawartość sodu ( hiponatremia)

2. za dużo wody (czemu towarzyszy pozorna hiponatremia)

Przyczyny hiperosmii:

1. hiperglikemia (najczęściej)

2. hipernatremia ( zbyt duża podaż hipotonicznego roztworu lub samodzielna hipernatremia)

3. uremia ( zwiększone stężenie mocznika w surowicy bądź innych produktów przemian)

4. zatrucie substancjami drobnocząsteczkowymi (etanol, metanol, glikol polietylenowy)

OBLICZANIE OSMOLALNOŚCI OSOCZA:

Osmolalność = 2 [Na⁺] + [ glukozy] + [ mocznika] jednostka wszystkich wartości - mmol/kg

->Przy normoglikemii i prawidłowym moczniku możemy uprościć ten wzór do postaci:

Osmolalność= 2[Na⁺] + 10

( ponieważ glukoza= 5 mmol/l i mocznik 5 mmol/l)

Obliczenia w stanie hiperproteinemi i hiperlipidemii mogą mieć duży błąd (wzrost suchej masy =rzekoma hipernatremia)

WSKAŹNIKI OSMOTYCZNE

LUKA OSMOLALNA (LO)

- Różnica między osmolalności zmierzoną a obliczoną

-prawidłowo powinna być <10 mmol/ kg H₂O

LO = osmolalność_zmierzona- osmolalność_obliczona

Wzrost LO >10 :

• zatrucie związkami drobnocząsteczkowymi

• zmniejszenie ilości wody w osoczu (wtedy rzekoma hipernatremia)

• w stanie hiperlipidemii i hiperproteinemii

STOSUNEK NATREMII DO OSMOLALNOŚCI OSOCZA

Prawidłowo : 0, 43 - 0,5

OSMOLALNOŚĆ MOCZU:

Prawidłowa wartość : 200 - 1400 mmol/ kg H₂O

Przy braku białka i cukru w moczu obliczamy osmolalność moczu na podstawie gęstości względnej moczu, mnożymy dwie ostatnie cyfry gęstości * 26

Np. gęstość moczu =1.015 to osmolalność wynosi 15*26 = 390 mmol/ kg H₂O

STOSUNEK OSMOLALNOŚCI MOCZU DO OSMOLALNOŚCI SUROWICY

.
prawidłowo
2

spadek do ok. 0,5 w zatruciu wodnym ( przewodnienie hipotoniczne)

spadek do ok. 0,2 w cukrzycy

KLIRENS OSMOLALNOŚCI :

C_osm=
Prawidłowo :
2

KLIRENS WOLNEJ WODY:

C_H2O= Obj. Moczu (ml/min) * (
) Prawidłowo : -3
+1

Wskaźnik	Wartości prawidłowa
Osmolalność surowicy	275- 295 mmol/ kg H2O
Osmolalność moczu	200 - 1400 mmol/ kg H2O
Natremia	135 - 145 mmol/l
Stężenie glukozy	70 - 100 mg/dl
Stężenie mocznika	0 - 38 mg/dl
Dobowa zbiórka moczu	1500 300 ml/dobę

Aby zamienić stężenie: glukozy z mg/ dl na mmol/ l to DZIELIMY przez 18

Mocznika z mg/ dl na mmol/ l to DZIELIMY przez 6

Aby zamienić dobową objętość moczu na ml/ min to dzielimy ją przez 1440 (liczba minut w dobie)

---